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1. HiPSC-Differenzierung in gemischte Neuronen und Glia
HINWEIS: Das Verfahren dauert ca. 28 Tage, wobei die wichtigsten Schritte in Abbildung 1 beschrieben sind.
- Erzeugung von Embryoidkörpern (EBs) (Tage 0 → 1)
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert gutes handwerkliches Geschick und Präzision. Die Koloniefragmente von HiPSC (humane induzierte pluripotente Stammzellen) sollten gleich groß sein, um in den nächsten Schritten homogene Embryoidkörper (EBs) zu erhalten. Morphologisch differenzierte Kolonien (mit großen zytoplasmatischen Fraktionen und kleinen Nukleolen) sollten verworfen werden.
- Frischen Sie das hiPSC-Medium (3 mL/60 mm Petrischale) auf, bevor Sie die undifferenzierten hiPSC-Kolonien (ca. 1 mm Durchmesser, siehe Abbildung 2A) unter sterilen Bedingungen schneiden.
- Schneiden Sie die undifferenzierten Kolonien (wie in Abbildung 2A und Abbildung 2B gezeigt) mit einer 1-ml-Spritze und einer 30G-Nadel in Fragmente von ca. 200 μm x 200 μm. Verwenden Sie ein stereoskopisches Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung in einem Laminar-Flow-Schrank bei Raumtemperatur.
- Lösen Sie die Koloniefragmente mit einer 200-μl-Pipette von der Schalenoberfläche, indem Sie das Medium vorsichtig darunter pipettieren, um die Stücke anzuheben.
- Übertragen Sie alle abgelösten Fragmente und das Medium mit einer 1-, 2- oder 5-ml-Pipette in ein 15-ml-Röhrchen.
- Spülen Sie die Schale mit 2 ml vollständigem hiPSC-Medium aus, um alle Fragmente zurückzugewinnen.
- Zentrifugieren Sie bei 112 x g für 1 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Fragmente vorsichtig in 5 mL vollständigem hiPSC EB-Medium (siehe Materialtabelle).
- Die Koloniefragmente werden in eine 60-mm-Petrischale mit extrem niedriger Bindung (5 mL/60 mm Petrischale) gegeben.
- Die Petrischale über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Sammeln Sie am nächsten Tag (Tag 1) die EBs und ihr Medium in einem 15-ml-Röhrchen mit einer 1-, 2- oder 5-ml-Pipette.
- Zentrifugieren Sie die EBs bei 112 x g für 1 min.
- Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die EBs vorsichtig in 5 ml vollständigem hiPSC-EB-Medium mit einer 1-, 2- oder 5-ml-Pipette.
- Setzen Sie die EBs wieder auf eine neue 60-mm-Petrischale mit extrem niedrigem Aufsatz (5 mL/60 mm Petrischale).
- Die Petrischale über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- An Tag 1 beschichten Sie die Schalen mit Basalmembranmatrix (z. B. Matrigel, im Folgenden als "Standardmatrix" bezeichnet) oder einem anderen geeigneten Proteinsubstrat (z. B. Laminin).
- Lagern Sie die Standardmatrix (siehe Materialtabelle) bei -80 °C in 200-μl-Aliquoten mit kalten 1,5-ml-Röhrchen und kalten 5- oder 10-ml-Pipetten.
- Tauen Sie 200 μl der Standardmatrix auf Eis auf.
- Verdünnen Sie 200 μl der Standardmatrix in 20 mL Basalmedium (DMEM/F12) (Verdünnung 1:100).
- Beschichten Sie 60-mm-Petrischalen mit dieser Lösung (5 ml/Schale).
- Die beschichteten Gerichte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Anmerkung: Diese Schalen werden verwendet, um die EBs zu plattieren (ca. 50 EBs/Schale) und neuroepitheliale Aggregate (Rosetten) zu erzeugen; Siehe Schritt 1.3.
- Bildung von neuroepithelialen Aggregaten (Rosetten) (Tag 2 → 7)
- Entfernen Sie an Tag 2 die Standard-Matrix-Beschichtungslösung aus den 60-mm-Petrischalen (die Platten müssen nicht gespült werden) und füllen Sie sie mit 5 ml/Schale mit vollständigem neuroepithelialem Induktionsmedium (NRI); siehe Materialtabelle.
- Übertragen Sie die schwimmenden EBs (aus Schritt 1.1.14) mit einer 200-μl-Pipette unter einem stereoskopischen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung auf beschichtete Schalen (~50 EBs/Schale) und legen Sie sie in einen Laminar-Flow-Schrank.
Anmerkung: Es ist wichtig, homogene, mittelgroße EBs (~200-300 μm Durchmesser) auszuwählen. Zu kleine EBs überleben während der neuroektodermalen Differenzierung möglicherweise nicht gut, während zu große EBs dazu neigen, eine Kernnekrose zu durchlaufen.
- Die Schalen bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Überprüfen Sie am nächsten Tag (Tag 3) die Schalen unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass alle EBs befestigt sind.
- Führen Sie vorsichtig einen vollständigen Mediumwechsel mit einem vollständigen NRI-Medium durch.
- Wechseln Sie das NRI-Medium jeden zweiten Tag bis zum 7. Tag, an dem neuroepitheliale Aggregate (Rosetten) sichtbar sein sollten.
- An Tag 7 wird die Standardmatrix (oder das Laminin), wie in Schritt 1.2 beschrieben, auf ein beliebiges erforderliches Platten- oder Schalenformat aufgetragen: 96-Well-Platten (100 μl/Well), 24-Well-Platten (250 μl/Well), 12-Well-Platten (500 μl/Well), MEA-Chips (für elektrische Aktivität, 1 mL/Single-Well-Chip) oder 60-mm-Petrischalen (4 mL/Schale).
- Die beschichteten Teller/Schalen mindestens 2 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Rosettendissoziation und neuronale Differenzierung (Tag 8 → 28)
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert gutes handwerkliches Geschick und Präzision. Um eine Ansammlung von mesodermalen und endodermalen Zellen zu vermeiden, sollten nur ektodermrosettenartige Strukturen dissoziiert und gesammelt werden.
- Schneiden Sie an Tag 8 die rosettenartigen Strukturen unter einem stereoskopischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung unter sterilen Bedingungen in Fragmente. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 30G-Nadel. Beachten Sie, dass sich die Rosetten bei leichtem Berühren mit der Nadel von der Schale lösen.
- Schließen Sie das Ablösen der Rosettenfragmente mit einer 200-μl-Pipette ab
.
- Übertragen Sie die Schale unter die Laminar-Flow-Haube und sammeln Sie die Rosettenfragmente und ihr Medium mit einer 1-, 2- oder 5-ml-Pipette in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie die Schale mit 2 ml NRI-Medium aus, um alle Fragmente zu entfernen.
- Die Rosettenfragmente bei 112 x g 2 min eindrehen.
- Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 mL 1x DPBS (ohne Calcium und Magnesium) und pipettieren Sie die Rosettenfragmente vorsichtig mit einer 1.000-μl-Pipette auf und ab, um sie teilweise zu dissoziieren.
- Fügen Sie 4 ml vollständiges NRI-Medium hinzu und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle)
Anmerkung: 20 μl Zellsuspension in 20 μl Trypanblau verdünnen. Dieser Schritt kann weggelassen werden, wenn die Zellen nicht in eine Einzelzellsuspension gebracht werden können. Wenn die Rosettenfragmente nicht vollständig dissoziiert aussehen, können Rosettenfragmente, die von etwa 50 EBs/60-mm-Schale stammen, in 50 mL vollständigem NRI-Medium resuspendiert und plattiert werden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
- Die Standard-Matrix-Beschichtungslösung (oder Laminin-Beschichtungslösung) wird aus den Petrischale, Platten und/oder MEA-Chips (aus Schritt 1.3.7) aspiriert. Lassen Sie sie nicht trocknen.
- Die Zellen werden gemäß dem Studienplan in einem vollständigen NRI-Medium plattiert (ca. 15.000 Zellen/cm2; siehe Tabelle 1 für die Angaben zum Plattierungsvolumen).
- Die Platten werden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- An Tag 10 wird ein totaler Mediumwechsel mit einem vollständigen neuronalen Differenzierungsmedium (ND) durchgeführt; siehe Materialtabelle.
- Frischen Sie das komplette ND-Medium zweimal pro Woche bis zum 28. Tag auf.
Tabelle 1.
Hinweis zur Dichte der dissoziierten Rosettenplattierung: Wenn Rosettenfragmente nicht vollständig dissoziiert aussehen, um eine Zellplattierungsdichte von ca. 15.000 Zellen/cm2 zu erreichen, können dissoziierte Rosettenfragmente, die von ca. 50 EBs/1 x 60mm-Schale stammen, in 50 mL vollständigem NRI-Medium resuspendiert und wie folgt plattiert werden (abhängig vom Plattenformat):
kg
kg
kg
| Multiwell-Platten / MEA | Wachstumsfläche (cm2/Well) | Volumen der Zellsuspension auf der Platte pro Well (oder MEA-Chip) | Maximale Anzahl von Platten, die plattiert werden können (mit 50 ml Zellsuspension) |
| 96 Brunnen | 0,3 | 100 UL | 5 |
| 48 Brunnen | 0,7 | 220 UL | 4 |
| 24 Brunnen | arabische Ziffer | 625 UL | 3 |
| 12 Brunnen | 4 | 1,25 ml | 3 |
| 6 Vertiefungen | 10 | 3.125 ml | arabische Ziffer |
| Single-Well-MEA-Chip | 3,5 | 1,1 ml | 45 |
