Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Dissoziation ventler Mittelhirnzellen
- Übertragen Sie die Teile des ventralen Mittelhirns unter eine Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die ausgewogene Salzlösung (HBSS) von Hanks und geben Sie 1 ml vorgewärmte (37 ºC) 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA) in das konische Röhrchen (Volumen reicht für bis zu 12 Stück ventrales Mittelhirn). Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ºC für 5-10 Minuten.
- Entfernen Sie Trypsin-EDTA unter der Haube und geben Sie 1 ml Deaktivierungsmedium (das Serum deaktiviert Trypsin) in das Gewebe
.
- Entfernen Sie das Deaktivierungsmedium und waschen Sie das Tuch zweimal in 1 ml des vollständigen Mediums.
Anmerkung: Um ein Verwerfen der dissoziierten Zellen zu verhindern, vermeiden Sie es, das gesamte Medium aus dem Röhrchen zu entfernen und das Gewebe zu pipettieren.
- Fügen Sie 1 ml vollständiges Medium hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Glaspipette. Vermeiden Sie die Blasenbildung und verreiben Sie weiter, bis eine einzellige Suspension erreicht ist.
HINWEIS: Normalerweise sind 8-10 Durchgänge durch die eingeschränkte Spitze erforderlich, um eine vollständige Dissoziation zu gewährleisten.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie das Medium.
- Suspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium, indem Sie es bis zu viermal langsam auf und ab pipettieren.
>2. Beschichtung ventraler Mittelhirnzellen
- Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 90 μl Trypanblau-Lösung und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
Anmerkung: Auch die Lebensfähigkeit der Zellen kann in diesem Stadium überprüft werden.
- Legen Sie die sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen in 100 mm Petrischalen und übertragen Sie die mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten Deckgläser mit einer Pinzette nacheinander auf die Kappen.
Anmerkung: Waschen Sie die Deckgläser nicht und vermeiden Sie es, das Laminin zu trocknen, da dies zu ungleichmäßigen Kulturen führen und die Überlebensfähigkeit der Zellen verringern kann.
- Stellen Sie das Volumen auf 1.500 Zellen pro 1 μl ein, indem Sie ein vollständiges Medium und 100 μl (insgesamt 150.000 Zellen) der Zellsuspension auf jedes Deckglas geben (das Volumen ist optimal, um die Oberfläche des Deckglases ohne Verschütten zu bedecken). Die Petrischalen verschließen und 1 Stunde in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) inkubieren.
Anmerkung: KRITISCHER SCHRITT: Dieser Schritt ist erforderlich, um die Anheftung und Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern und die Anzahl der Deckgläser pro Embryo zu erhöhen. Alternativ können die Zellen direkt in die Wells (mit Deckgläsern) übertragen werden, die Anzahl der Zellen sollte jedoch auf 350.000 pro Well (statt 150.000) erhöht werden. Mit anderen Worten, mit dieser Methode können 8-10 Deckgläser erworben werden, während die direkte Übertragung aufgrund der Zellen, die an den Platten (neben oder unter den Deckgläsern) befestigt sind, etwa 3-4 Deckgläser ergibt. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit der Kulturen mit dieser Methode lag bei etwa 90 %.
>3. Kulturwachstum und -pflege
- Nach 1 Stunde Inkubation werden die Deckgläser einschließlich des Mediums vorsichtig in 24-Well-Platten mit 400 μl vorgewärmtem (auf 37 ºC) vollständigem Medium (Gesamtvolumen: 500 μl) überführt. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (O/N) bei 37 ºC.
- Geben Sie innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation der Vertiefungen vorsichtig 500 μl vollständiges Medium in jede Vertiefung.
HINWEIS: Die ersten Stunden sind das kritischste Stadium für das Überleben der dopaminergen Neuronen, und die Anzahl der überlebenden Zellen ändert sich ab diesem Zeitpunkt nicht signifikant.
- Fügen Sie den Kulturen in den ersten zwei Wochen oder bis das Medium gelb wird, kein zusätzliches Medium hinzu. Wenn Sie länger als zwei Wochen kultivieren oder die Farbe des Mediums gelb wird, tauschen Sie die Hälfte des Mediums (500 μl) gegen frisches, vollständig vorgewärmtes Medium aus (in der Regel alle zwei Wochen).
Anmerkung: Dopaminerge Neuronen in den Kulturen würden unter diesen Bedingungen mehr als sechs Wochen überleben.
