Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Entnahme von Gewebeproben
HINWEIS: Eine kritische Komponente dieses Protokolls erfordert die ordnungsgemäße Handhabung der Gewebespende, die unmittelbar zum Zeitpunkt der Autopsie beginnt. Die allgemeine Lebensfähigkeit der Probe hängt wesentlich von der Minimierung des Post-Mortem-Intervalls (PMI), der sofortigen Überführung des Gewebes in das geeignete kalte Medium, das mit Antibiotika/Antimykotika ergänzt wird, der Aufbewahrung der Probe auf nassem Eis während des gesamten Transports und der Aufrechterhaltung einer sterilen Technik während des gesamten Protokolls ab.
- Bei Benachrichtigung über eine bevorstehende Spende bereiten Sie ein Probenentnahmeset vor. Bei Verwendung eines Versandkartons mit einem isolierten Behälter, der direkt für den Rücktransport der Gewebeprobe verwendet werden kann, sollten folgende Materialien enthalten sein:
- Fügen Sie Materialien für die sterile Zubereitung hinzu, einschließlich steriler Handschuhe, Vorhänge und Skalpelle.
- Fügen Sie 8 - 10 sterile konische 50-ml-Röhrchen mit 30 mL Versandmedium in den isolierten Behälter mit Eis- oder Kühlakkus ein.
Anmerkung: Während alle Standard-Zellkulturmedien funktionieren können, wird die beste Probenviabilität mit Hibernate-A erreicht, das mit einem Antibiotikum/Antimykotikum ergänzt wird.
Fügen - Sie weitere Probenröhrchen für andere Analysen (z. B. Fixiermittel) hinzu.
- Wenn die Autopsie nicht am Ort des Prüfarztes durchgeführt wird, fügen Sie ein Dokument bei, aus dem klar hervorgeht, wie die Tumorprobe entnommen wird. Dazu gehören Details wie die Aufrechterhaltung der Sterilität, die Aufbewahrung von Probenröhrchen auf nassem Eis und die Einbeziehung von Proben aus dem Mittelhirn und der Medulla, da Tumorzellen häufig in diese Regionen eindringen.
- Halten Sie die Sterilität während der Autopsie aufrecht. Betrachten Sie das Gehirn im Inneren des Schädels als steril, also beobachten Sie die sterile Technik (einschließlich des Wechselns der Handschuhe), sobald der Schädel geöffnet ist. Die Vermeidung von Kontaminationen mit Haut und Haaren ist von entscheidender Bedeutung.
- Präparieren Sie den Tumor von der ventralen Seite (dem "Bauch" der Pons, siehe Abbildung 1). Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell kleine 1 cm große Stücke aus dem Tumor ab und überführen Sie sie sofort in kalte Versandmedien (siehe HINWEIS in Schritt 1.1.2) und legen Sie sie auf nasses Eis. Geben Sie 10 ml Gewebe in jedes Röhrchen, was zu einem endgültigen Volumen an Gewebe und Medien in jedem Röhrchen von 40 ml führt.
Anmerkung: Beim diffusen intrinsischen Ponsgliom (DIPG) infiltriert der Tumor diffus die Pons und häufig den Rest des Hirnstamms. Entnehmen Sie daher so viel wie möglich von der Probe, in der Regel 3 - 4 Röhrchen (30 - 40 ml Gewebe) aus dem Pons und 1 - 2 Röhrchen (10 - 20 ml Gewebe) aus dem Mittelhirn und der Medulla.
- Sammeln Sie Proben aus dem Mittelhirn und der Medulla gegenüber den Pons, die oft viele Tumorzellen enthalten.
- Versenden Sie die Proben nach der Probenentnahme über Nacht (O/N) auf Nasseis im isolierten Behälter. Versenden Sie die Probe nicht auf Trockeneis, da das Einfrieren die Zellen abtötet.
>2. Vorbereitung für die Probenverarbeitung
- Sterilisieren Sie vor Beginn der Probenvorbereitung die Gewebekulturhauben zusammen mit Rasierklingen, gebogenen Hämostaten und anderen unsterilen Werkzeugen 1 Stunde lang unter ultraviolettem (UV) Licht. Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen durch, um eine Kontamination der Kulturen zu verhindern.
- Bereiten Sie Filterlösungen vor und sterilisieren Sie sie.
- Zur Herstellung von 1,8 M Saccharoselösung 308,07 g Saccharose in 300 ml destilliertem Wasser auflösen. Fügen Sie 50 ml 10x Hank's-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) ohne Kalzium oder Magnesium hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 500 ml. Bei 4 °C lagern.
- Zur Herstellung einer enzymatischen Aufschlusslösung nehmen Sie 50 ml HBSS mit Calcium und Magnesium pro 10 ml zerkleinertes Gewebe und fügen Sie 500 μl 5 mg/ml Desoxyribonuklease I (Endkonzentration 50 μg/ml), 500 μl 2,5 mg/ml Kollagenase I/II und Dispaselösung (Endkonzentration 25 μg/ml) hinzu. und 500 μL 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)-Puffer. Aufschlusslösung in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
- Zur Herstellung von Tumorstammmedien (TSM) mischen Sie 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F12 (DMEM/F12), 5 ml 100x Antibiotikum-Antimykotikum, 5 ml 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-Puffer, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 5 ml 100x MEM nicht-essentielle Aminosäuren.
- Um ein vollständiges TSM mit Wachstumsfaktoren herzustellen, fügen Sie der TSM-Basis die folgenden Ergänzungen hinzu: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (1:50), humaner epidermaler Wachstumsfaktor (H-EGF, 20 ng/ml), humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor (H-FGF, 20 ng/ml), humaner Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor AA (H-PDGF-AA, 10 ng/ml), humaner Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor BB (H-PDGF-BB, 10 ng/ml) und Heparinlösung (2 μg/ml).
- Eine Laborzentrifuge, die mit einem Ausschwingrotor ausgestattet ist, auf 4 °C vorkühlen.
>3. Mechanische Dissoziation
- Übertragen Sie das Gewebe in eine hochwandige 100 mm x 20 mm große Zellkulturschale. Entfernen Sie Medienreste aus dem Versand und ersetzen Sie sie durch 10 - 15 mL Kaltkulturmedien.
- Mit den gebogenen Hämostaten greifen Sie eine Rasierklinge, zerkleinern Sie das Gewebe fein und entfernen Sie dabei sichtbare Blutgefäße oder Hirnhäute.
Anmerkung: Die endgültigen Gewebefragmente sollten kleiner als 1 mm sein (siehe Abbildung 2B).
- Übertragen Sie das Gewebe in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Zellkulturschale mit zusätzlichen 5 mL Kaltkulturmedium und geben Sie sie in das konische Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt bei Bedarf, um restliches Gewebe zu übertragen.
- Mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig (4 - 5 mal) zerkleinern. Lassen Sie größere Gewebefragmente am Boden des Röhrchens absetzen. Bei Bedarf die Probe 1 min (350 x g, 4 °C) kurz zentrifugieren.
- Sammeln Sie die mechanisch dissoziierte Fraktion.
- Entfernen Sie den Überstand und filtrieren Sie ihn durch einen 100-μm-Filter in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Mechanische Dissoziation". Drehen Sie den Filter über das ursprüngliche konische Röhrchen und waschen Sie ihn mit Nährmedien, um Gewebefragmente zu gewinnen.
- Die Fraktion "Mechanische Dissoziation" wird 5 min lang (350 x g, 4 °C) zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand aus der pelletierten Fraktion "Mechanische Dissoziation" und suspendieren Sie das Gewebe in kalten Kulturmedien. Wenn sich mehr als 5 ml Gewebe im konischen Röhrchen "Mechanische Dissoziation" befinden, teilen Sie das Gewebe in andere konische 50-ml-Röhrchen auf, so dass kein Röhrchen mehr als 5 ml Gewebe enthält.
- Die mechanisch dissoziierte Fraktion wird bis zum Schritt der Saccharosegradientenzentrifugation (Schritt 5) auf Eis gelagert. Alternativ kann die mechanisch dissoziierte Fraktion während der enzymatischen Dissoziationsinkubationszeit (Schritt 4.4) zu Schritt 5 übergehen.
>4. Enzymatische Dissoziation
- Wenn sich mehr als 5 ml Gewebe in dem Röhrchen befinden, das die verbleibenden größeren Gewebefragmente enthält, teilen Sie das Gewebe in andere neue konische 50-ml-Röhrchen auf, so dass kein Röhrchen mehr als 5 ml Gewebe enthält.
- Das/die konische(n) Röhrchen(e) mit den restlichen Gewebefragmenten wird 5 min lang (350 x g, 4 °C) zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie die vorgewärmte enzymatische Aufschlusslösung hinzu, so dass 5 ml Aufschlusslösung für jedes 1 ml Gewebe vorhanden sind (z. B. 25 ml Aufschlusslösung für 5 ml Gewebe).
- Die konischen Röhrchendeckel mit Laborfolie verschließen und die Reaktion auf einem Rotator bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Nach der Inkubation werden die Proben vorsichtig verzerrt (siehe Abbildung 2C).
- Pipettieren Sie die Probe mit einer serologischen 10-ml-Pipette 6 - 8 Mal auf und ab. Vermeiden Sie die Bildung übermäßiger Luftblasen.
- Fügen Sie eine 1.000-μl-Pipettenspitze am Ende der Pipette hinzu und verreiben Sie sie weitere 6 - 8 Mal.
- Lassen Sie alle verbleibenden Stücke am Boden des Rohrs absetzen. Den Überstand mit den noch suspendierten Zellen durch einen 100-μm-Filter entfernen und in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Enzymatische Dissoziation" filtrieren und auf Eis lagern.
- Wenn signifikante Gewebefragmente verbleiben, fügen Sie den Fragmenten zusätzlich 10 ml HBSS mit Calcium und Magnesium hinzu und wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2. Diese wird durch einen 100 μm Filter in das Röhrchen "Enzymatische Dissoziation" filtriert.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen "Enzymatische Dissoziation" für 5 min (350 x g, 4 °C) und fahren Sie mit der Saccharosegradientenzentrifugation fort.
>5. Saccharose-Gradientenzentrifugation
- Wenn die Proben noch in Lösung suspendiert sind, 5 min (350 x g, 4 °C) zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Gewebe in 20 mL kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium. Bringen Sie das Volumen mit kaltem HBSS auf insgesamt 25 ml.
- Fügen Sie langsam 25 mL 1,8 M Saccharoselösung hinzu und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um. Daraus ergibt sich ein Saccharosegradient von 0,9 M.
- Zentrifuge ohne Bremse für 10 min (800 x g, 4 °C). Die Verwendung einer Zentrifugationsbremse stört den Gradienten und verringert die Ausbeute (siehe Abbildung 2D für ein Beispiel einer Probe vor und nach der Zentrifugation).
- Aspirieren Sie vorsichtig Myelinreste und so viel Saccharoselösung wie möglich. Waschen Sie die Probe, indem Sie 30 mL kaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzufügen und vorsichtig mischen. 5 min (350 x g, 4 °C) zentrifugieren.
>6. ACK Lyse roter Blutkörperchen
- Entfernen Sie den Waschüberstand. Fügen Sie 5 mL ACK-Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 1 Minute lang bei RT schwenken.
- Beenden Sie die Lyse durch Zugabe von 30 mL kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium.
- 5 min (350 x g, 4 °C) zentrifugieren.
>7. Anfängliche Pflege der Kultur
- Resuspendieren Sie die endgültigen Zellpellets in 10 - 15 mL warmem vollständigem TSM mit Wachstumsfaktoren und quantifizieren Sie die lebensfähige Zelldichte auf einem Hämozytometser unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses.
Anmerkung: Das Spektrum der lebensfähigen Zellen variiert stark je nach den Umständen der Gewebespende, und die Quantifizierung kann in diesem frühen Stadium aufgrund der übrig gebliebenen Zelltrümmer schwierig sein. Im Idealfall sollten Sie eine Million lebende Zellen pro Probe anstreben. In Fällen, in denen übermäßige Ablagerungen zurückbleiben, mit geringerer Dichte in einem T175-Kolben plattieren.
- Die endgültigen Zellsuspensionen werden in einen neuen T75-Kulturkolben überführt. Jeden zweiten Tag zusätzliche Wachstumsfaktoren zuführen, um die Gesamtspiegel der Wachstumsfaktoren aufrechtzuerhalten und die Entwicklung der Tumorzell-Neurosphären zu überwachen (siehe Abbildung 2E und Abbildung 3).
