Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen des Rückenmarks in Motoneuronen

Zusammenfassung

Quelle: Taga, A. et al., Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen Astrozyten und Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) des Rückenmarks in Motoneuronen. Es beschreibt den Kultivierungsprozess der NPCs auf einer beschichteten Kulturplatte unter Verwendung spezieller Medien, die mit spezifischen Inhibitoren angereichert sind, um die NPC-Differenzierung in reife Motoneuronen zu erleichtern.

Protokoll

>1. Auftauen von Kulturen neuraler Vorläuferzellen (NPC)

1. Beschichten Sie 10 cm große Platten am Tag vor dem Auftauen der Zellen mit Polyornithin (PLO) und Laminin.
   1. 5 ml PLO auf 100 μg/ml verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder destilliertem Wasser (dH₂O) auf die Platten geben. Bei 37 °C mindestens 1 h bis über Nacht inkubieren.
   2. Aspirieren Sie die PLO-Lösung und spülen Sie die Platten dreimal mit PBS aus. (PLO ist giftig, wenn es nicht richtig gewaschen wird.)
   3. Geben Sie in PBS verdünntes Laminin in einer Konzentration von 10 μg/ml in die PLO-beschichteten Platten. Bei 37 °C mindestens 1 Stunde inkubieren, vorzugsweise über Nacht. Nach der Inkubation ist die Lamininlösung ohne Spülen zu aspirieren, um die Zelladhäsion zu verbessern.
      Anmerkung: Die Platten können im Voraus mit PLO beschichtet, dreimal mit Wasser gewaschen, in einer sterilen Haube getrocknet und bei 4 °C gelagert werden.
2. Tauen Sie ein NPC-Fläschchen mit 6 x 10⁶ Zellen/Fläschchen für jede 10-cm-Zellkulturplatte auf.
3. Nehmen Sie das NPC-Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie es sofort für bis zu 2 min in ein 37 °C heißes Wasserbad. Tauen Sie es schnell auf, indem Sie das Fläschchen schütteln, bis ein kleines Eisstück von Flüssigkeit umgeben ist.
4. Übertragen Sie die Zellaggregate mit einer 1000-μl-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie bis zu 15 mL vorgewärmtes neuronales Differenzierungsmedium (NDM) oder Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 Supplement hinzu, um das Dimethylsulfoxid (DMSO) zu verdünnen.
5. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren.
6. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet mit Motoneuron (MN)-Differenzierungsmedium (Tabelle 1) + ROCK-I (20 μM) und zerkleinern Sie mit einer 1000-μl-Pipette auf und ab, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird (bis zu 5 Mal).
7. Übertragen Sie die einzellige Suspension auf eine mit PLO-Laminin beschichtete 10 cm Platte.
8. Bringen Sie die Platte in einen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ungestört, damit die Zellen richtig adhäsieren
können

>2. Differenzierung von Rückenmarks-NPC in Motoneuronen

1. Führen Sie die ersten Schritte wie in den Schritten 1.1-1.8 beschrieben durch, wobei das letzte Medium MN-Differenzierungsmedium + ROCK-I (20 μM) ist.
2. Führen Sie am Tag nach der Beschichtung einen vollständigen Austausch des Mediums gegen MN-Differenzierungsmedium ohne ROCK-I durch und wechseln Sie dann jeden zweiten Tag das Medium. Füttern Sie die Zellen am Freitag und dann wieder am Montag. Spülen Sie die Zellen bei Bedarf mit PBS, um Zelltrümmer zu entfernen.
3. Wechseln Sie das Medium mit MN-Differenzierungsmedium + Cytosin-Arabosid (ARA-C) (0,02 μM) und inkubieren Sie es 48 h lang, wenn gliale Vorläuferzellen als einzelne proliferierende flache Zellen unter postmitotischen MN-Vorläuferzellen auftreten, die in Zellclustern aggregiert sind.
   Anmerkung: In der Regel geschieht dies innerhalb der ersten 7 Tage nach der ersten Beschichtung, obwohl es je nach Zelllinie zu Schwankungen kommen kann.
4. Nach 48 h aspirieren Sie das ARA-C-haltige Medium, spülen Sie die Kulturen dreimal vorsichtig mit PBS und wechseln Sie das Medium auf frisches MN-Medium ohne ARA-C.
5. Führen Sie nach der Behandlung mit ARA-C jeden zweiten Tag (oder Montag, Mittwoch und Freitag) einen Medienwechsel durch, indem Sie das alte Medium mit einer manuellen Pipette anstelle eines Vakuumsaugers entfernen, um eine vorzeitige Ablösung von neuronalen Clustern zu verhindern. Darüber hinaus reichern Sie das MN-Medium einmal pro Woche mit Laminin 1 μg/ml an, um die neuronale Bindung an die Kulturplatten weiter zu verbessern.

Tabelle 1: Kulturmedien

Name des Mediums	reagenzien	Konzentrationen
Neuronales Differenzierungsmedium (NDM)	Neurobasal L-Glutamin Nicht-essentielle Aminosäuren Nachtrag N - N2 Zutrag Penicillin/Streptomycin	1x 100x 100x 100x 100-fach
Differenzierungsmedium für Motoneuronen	Neuronale Differenzierung medium Ascorbinsäure Puromorphamin Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor Ziliärer neurotropher Faktor Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 Neurotropher Faktor aus Gliazelllinien Retinsäure Verbindung E Beilage B - B27 Beilage	1x 0,4 μg/ml 1 μM 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 1 μM 125 nM 50-fach

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm sterile Kulturplatten	Falke	353003
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Thermofischer	11140050	Arbeitskonzentration 100x
Beilage N - N2 Beilage	Thermofischer	17502048	Arbeitskonzentration 100x
L-Glutamin	Thermofischer	Artikel-Nr.: 25030	Arbeitskonzentration 100x
Neurobasal	Thermofischer	21103049	Arbeitskonzentration 1x
Retinsäure (RA)	Sigma	Nr. R2625	Löse 100 mg in 3,3 ml DMSO auf, um 100 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Stammstoff auf 100 μl/Röhrchen und frieren Sie ihn bei -80 ºC ein. Nehmen Sie 200 μl 100 mM Stamm und verdünnen Sie ihn 10x (fügen Sie 1,8 mL DMSO hinzu), um 10 mM Stamm herzustellen. 50 μl/Röhrchen aliquotieren und bei -80 ºC lagern. Zur Verwendung auf 1:10000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 2 μM).
Polyornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	Nr. P3655	Löse 100 mg in 1 mL ddW auf, um 100 mg/ml Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Stamm in 100 μL-Röhrchen. (Arbeitskonzentration 100 μg/ml)
Laminin	Thermofischer	Artikel-Nr.: 23017-015	Stammlösung 1 mg/ml, Arbeitskonzentration 10 μg/mL (Beschichtung), 1 μg/mL (Zellmedien)
Ascorbinsäure (ASAC)	Sigma	Nr. A4403	Lösen Sie 100 mg in 250 ml dH2O auf, um 0,4 mg/ml Brühe zu erhalten. Sterilfiltrieren Sie ihn durch einen 0,22-μm-Filter, aliquotieren Sie ihn und frieren Sie ihn bei -80 ºC ein. Zur Verwendung bei 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 0,4 μg/ml).
Ziliärer neurotropher Faktor (CNTF)	Peprotech	Nr. 450-13	Löse 100 μg in 1 ml sterilem PBS auf und füge dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Verbindung E	Abcam (Englisch	AB142164	Lösen Sie 250 μg in 2,0387 mL DMSO, um einen 250 μM Stamm zu erhalten. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung 1:2000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 125 nM).
DMEM/F12	Thermofischer	Artikel-Nr.: 113300	Arbeitskonzentration 1x
Neurotroph aus Gliazelllinien (GDNF)	Peprotech	Nr. 450-10	Lösen Sie 100 μg in 1 ml PBS auf 100 μg/ml auf und fügen Sie dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
ROCK-I Blockierer	Peprotech	1293823	5 mg in 1480 μl dH2O auflösen, um 10 mM Stamm zu erhalten, aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1:500 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 μM).
Bleistift/Streptomycin	Thermofischer	15140122	Arbeitskonzentration 100x
Purmorphamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Lösen Sie 5 mg in 9,6 ml DMSO auf, um 1 mM Lösung zu erhalten. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 1 μM).
Rekombinanter neurotropher Faktor (BDNF) des menschlichen Gehirns	Peprotech	Nr. 450-02	Vor der Rekonstitution kurz zentrifugieren. Löse 100 μg in 1 ml PBS auf 100 μg/ml auf und füge dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1)	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 291-G1-200	200 μg in 2 mL PBS auf 100 μg/ml auflösen, dann 18 mL 0,1 %BSA-PBS zu 10 μg/mL Stamm hinzufügen und bei -80 ºC lagern. Aliquot und bei -80 ºC einfrieren. 10 μg/mL Stamm zur Verwendung bei 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Neurotroph aus Gliazelllinien (GDNF)	Peprotech	Nr. 450-10	Lösen Sie 100 μg in 1 ml PBS auf 100 μg/ml auf und fügen Sie dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Retinsäure (RA)	Sigma	Nr. R2625	Löse 100 mg in 3,3 ml DMSO auf, um 100 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Stammstoff auf 100 μl/Röhrchen und frieren Sie ihn bei -80 ºC ein. Nehmen Sie 200 μl 100 mM Stamm und verdünnen Sie ihn 10x (fügen Sie 1,8 mL DMSO hinzu), um 10 mM Stamm herzustellen. 50 μl/Röhrchen aliquotieren und bei -80 ºC lagern. Zur Verwendung auf 1:10000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 2 μM).
Verbindung E	Abcam (Englisch	AB142164	Lösen Sie 250 μg in 2,0387 mL DMSO, um einen 250 μM Stamm zu erhalten. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung 1:2000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 125 nM).
Beilage B - B27 Beilage	Thermofischer	21985023	Arbeitskonzentration 50x
Sterile Zellkulturhauben	Bäcker-Unternehmen	SG-600
Tisch-Zellkulturzentrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Wasserbad	ThermoFisher	Nr. 2332	Isotemp
Feuchtigkeitskontrollierter Zellkultur-Inkubator	ThermoFisher	370	eingestellt auf 37 ºC, 5 % CO2

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