Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitungen
- Vorbereitungen für die Isolierung von CGNP (cerebellärer granulärer Neuronenvorläufer)
- Organisieren Sie eine geeignete Verpaarung von Mäusen, um P5-P7-Tiere zu erzeugen, um das Kleinhirn zu isolieren (3-5 Tiere pro ChIP und Zustand).
- Bereiten Sie HBSS/Glukose vor, indem Sie dem HBSS-Puffer 6 mg/ml Glukose hinzufügen.
- Bereiten Sie das CGNP-Zellkulturmedium (CGM) vor, indem Sie DMEM-F12 1 % (v/v) N2-Supplement, 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl und 10 % FCS zusetzen. Für die CGNP-Kultivierung ist das CGM-Medium ohne FCS, aber mit 0,6 μg/mL sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) vorzubereiten und bei Bedarf auf 37 °C zu äquilibrieren.
- Beschichten Sie 6-Well-Zellkulturplatten mit 100 μg/ml Poly-D-Lysin für 1-2 h bei RT für die Gliazellentfernung. Anschließend zweimal mit sterilem ddH2O waschen und die Platten trocknen lassen. Lagern Sie die Platten maximal eine Woche bei 4 °C.
- Für die Kultivierung von CGNPs beschichten Sie 6-Well-Zellkulturplatten über Nacht mit Poly-L-Ornithin (0,1 mg/ml) bei 4 °C. Anschließend zweimal mit H2O für die Zellkultur waschen und die Platten trocknen lassen.
Anmerkung: Die Platten können maximal eine Woche bei 4 °C gelagert werden.
- 0,025 % Trypsin (w/v) in HBSS/Glucose zubereiten und bei Bedarf auf 37 °C ausgleichen.
- Isolierung von neuralen Vorläuferzellen aus Hirngewebe
- Isolierung und optionale Kultivierung von CGNPs (zerebelläre granuläre Neuronen-Vorläuferzellen)
- Euthanasieren Sie P5-7-Tiere durch Enthauptung mit einer Schere. Entferne die Kopfhaut, öffne den Schädel und entferne das Gehirn mit einer kleinen Schere und Pinzette. Isolieren Sie das Kleinhirn und übertragen Sie es auf eiskaltes HBSS/Glukose. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Blutgefäße und überführen Sie das Kleinhirn in 15 ml-Röhrchen, die mit kaltem HBSS/Glukose gefüllt sind.
- Waschen Sie das Kleinhirn dreimal mit 10 mL eiskaltem HBSS/Glucose (sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 650 x g für 5 min bei 4 °C) und homogenisieren Sie die Cerebella anschließend, indem Sie mit einer 1 mL-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren (maximal 2-3 Mal), um 0,5-1 mm3 Fragmente zu erhalten.
- Fügen Sie 5 mL 0,025% Trypsin in HBSS/Glucose hinzu und inkubieren Sie das Gewebe unter ständigem Rühren in einem 37 °C Wasserbad für 15 min. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 5 mL CGM hinzufügen und sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation bei 650 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und zerreiben Sie das Gewebe mit einer 1 mL Pipettenspitze in 1 mL CGM und übertragen Sie es in ein neues 15 mL Röhrchen.
Anmerkung: Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden.
- Fügen Sie 5 mL CGM hinzu und inkubieren Sie die Mischung 2 Minuten lang auf Eis, um Gewebereste abzusetzen. Den Überstand in ein neues 15-ml-Röhrchen überführen. Geben Sie 2 mL CGM in das Restgewebe und wiederholen Sie den Verreibvorgang.
- Die Überstände (ohne Gewebereste, insgesamt ca. 10 mL) poolen und bei 650 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Kleinhirnzellen zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL CGM.
- Da Astrozyten schneller und stärker an Poly-D-Lysin haften als CGNPs, plattieren Sie die Zellen auf 100 μg/mL Poly-D-Lysin-beschichtete 6-Well-Platten (bis zu 4 mL pro Well) und inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 °C, um die Astrozyten zu entfernen.
- Schütteln Sie den Teller und sammeln Sie den Überstand auf. Anschließend bei 650 x g für 5 min bei 4 °C in einem 15 mL Röhrchen zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL CGM und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer.
Anmerkung: CGNPs sind rund, klein und zeigen einen Halo, wenn sie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie abgebildet werden.
- Bei Bedarf die Zellen in 37 °C vorgewärmtem CGM auf Poly-L-Ornithin-beschichtete Platten (3 x 106 Zellen pro 6-Well) aussäen und bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % relativer Luftfeuchte inkubieren.
Anmerkung: Das Belassen von CGM auf den Platten (und damit auf dem FBS) führt zur Differenzierung der CGNPs in zerebelläre granuläre Neuronen (CGNs).
