>1. Generierung von kortikalen Hirnorganoiden (Abbildung 1)
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt des Protokolls werden in einer Biosicherheitshaube der Klasse 2 durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- Induktion von neuroektodermalen 2D-Kolonien aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) 2D-Kultur (Tage -1 bis 3)
- Vor der Induktion werden die hPS-Kolonien auf einer für humane embryonale Stammzellen (hESC) qualifizierten Basalmembranmatrix in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 20 % bis 30 % plattiert. Diese Dichte wird erreicht, indem hPSC-Kolonien aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 60 % Konfluenz in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte übertragen werden.
- Für die Beschichtung der Basalmembranmatrix verdünnen Sie die Basalmembranmatrix im Verhältnis 1:50 in einem einfachen Basalmedium. 1 ml/Vertiefung einer 6-Well-Platte gleichmäßig ablegen, 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und dann aspirieren.
- Halten Sie hPSC-Kolonien vor der Differenzierung 1 Tag lang in 2 ml eines serumfreien Zellkulturmediums.
- Am Tag der hPS-Differenzierung sind die hPS-Kolonien mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie bei 4- bis 10-facher Vergrößerung zu untersuchen, um sicherzustellen, dass gesunde Kolonien ohne nachweisbare Differenzierung vorhanden sind.
Anmerkung: Gesunde hPSCs bilden enge Randkolonien mit Zellen, die einen großen Zellkern, ein sehr kleines Zytoplasma und prominente Nukleolen haben. Differenzierte iPS-Kolonien weisen deutliche morphologische Unterschiede zu den oben beschriebenen hPS-Kolonien auf, insbesondere an den äußeren Rändern der Kolonien oder in der Mitte.
- Fügen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien hinzu, um das für die Differenzierung erforderliche N2-Medium zu bilden. Bringen Sie dieses Medium vor der Verwendung auf RT.
- Sobald Sie bei RT sind, aspirieren Sie das serumfreie Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte und ersetzen Sie es durch 2 ml N2-Medium, das vorsichtig mit einer serologischen 5-ml-Pipette hinzugefügt wird.
- Fügen Sie den dualen Suppressor der Mütter gegen Dekapentaplegika (SMAD)-Inhibitoren SB-431542 (10 μM) und LDN 193189 (100 nM) hinzu.
Anmerkung: Die SMAD-Inhibitoren können dem N2-Medium zugesetzt werden, nachdem das Medium in jede Vertiefung gegeben wurde, oder der erforderlichen Menge an N2-Medium, bevor das serumfreie Zellkulturmedium ausgetauscht wird. Inhibitoren können gleichmäßig in das Medium eingearbeitet werden, indem die Platte vorsichtig geschwenkt oder das Röhrchen mit dem Medium und den Inhibitoren 3-4 Mal umgedreht wird.
- In den nächsten 2 Tagen täglich frisches N2-Medium mit SB-431542 (10 μM) und LDN 193189 (100 nM) in jede Vertiefung geben.
Anmerkung: Frisches N2-Medium wird zugesetzt, um die anhaltende Exposition der Zellen gegenüber dem Dimethylsulfoxid (DMSO) zu reduzieren, das zum Auflösen von SB-431542 und LDN 193189 Verbindungen verwendet wird, und um Zytotoxizität zu verhindern.
- Erzeugung von 3D-Neuroektodermal-Sphäroiden aus induzierten 2D-Neuroektodermal-Kolonien (Tage 3 bis 7)
- Heben Sie die induzierten neuroektodermalen Kolonien mit Dispase an, indem Sie die Schritte 1.2.2-1.2.8 befolgen.
- Entfernen Sie zuerst 2 ml N2-Medium von der 6-Well-Platte und waschen Sie es 1x mit HBSS, um sicherzustellen, dass das gesamte N2-Medium entfernt wird.
Anmerkung: N2-Medium kann die Enzymaktivität der Dispase stören und eine adäquate Ablösung der neuroektodermalen Kolonien aus der Vertiefung verhindern.
- Geben Sie 1 ml 2,4 Einheiten/ml Dispase in jede kolonieenthaltende Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Vertiefung 20-25 min (maximal 30 min) bei 37 °C und kontrollieren Sie regelmäßig, ob sich die Kolonie ablöst.
Anmerkung: Kleine Völker können sich innerhalb von 20 Minuten ablösen. Alle Völker, die nach 30 Minuten noch festsitzen, sollten ignoriert werden.
- Nach der Inkubation wird 1 ml N2-Medium in die Vertiefung gegeben, um die Aktivität des Dispase-Enzyms zu stoppen, und die Kolonien mit einer P1000-Pipettenspitze mit breitem Durchgang oder einer modifizierten P1000-Pipettenspitze, die mit einer sterilen Schere geschnitten wurde, in ein 15-ml-Röhrchen überführt (es handelt sich also um eine P1000-Spitze mit breitem Durchgang).
- Lassen Sie die Kolonieklumpen mit der Schwerkraft auf den Boden der Röhre sinken.
Anmerkung: Dieser Vorgang dauert ca. 1 Minute.
- Sobald die Klumpen abgesunken sind, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Standard-Pipettenspitze P1000 und ersetzen Sie ihn durch 1 ml frisches N2-Medium. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um sicherzustellen, dass die Dispase.
Anmerkung: Eine verbleibende Dispase verhindert eine gleichmäßige Bildung von neuroektodermalen Sphäroiden und induziert den Zelltod.
- Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Zellklumpen in 3 ml N2-Medium, geben Sie sie in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und fügen Sie 40 ng/ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) hinzu.
Anmerkung: Wenn eine große Anzahl von neuroektodermalen Kolonien abgelöst würde, könnten diese Kolonien über zwei oder mehr Vertiefungen einer 6-Well-Platte plattiert werden, um eine Fusion der Sphäroide zu verhindern. 24 h nach der Dispase-Ablösung der Kolonien prüfen, ob sich die Sphäroide gebildet haben.
- Bewahren Sie die Sphäroide für die nächsten 3-4 Tage im gleichen Medium auf, fügen Sie jedoch täglich frisches bFGF (40 ng/ml) zu jeder Vertiefung hinzu, um die neuroektodermale Zellproliferation zu fördern, sich selbst zu organisieren und Neuroepithelien zu induzieren und zu erweitern.
Anmerkung: Wenn Sphäroide mit einer höheren Dichte plattiert wurden, wird das Medium wahrscheinlich gelb und muss alle 2 Tage durch frisches bFGF (40 ng/ml) ersetzt werden. Dies wird jedoch nicht empfohlen, und stattdessen sollte in jeder Vertiefung eine geringere Anzahl von Sphäroiden beibehalten werden, um dieses Problem zu vermeiden. Sphäroide können nach 3 Tagen in die Basalmembranmatrix eingebettet werden, wenn Neuroepithelien erkennbar sind. Wenn Neuroepithelien nicht offensichtlich sind oder nicht stark aussehen, behalten Sie die Sphäroide für einen weiteren Tag bei und überprüfen Sie sie erneut.
Tabelle 1: N2 Mittel. In der Tabelle sind die Reagenzien aufgeführt, die zur Vorbereitung des N2-Mediums erforderlich sind.
| Medienkomponenten | Konzentration |
| DMEM Nährstoffmischung F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| N2 Zusatz 5 mL (100x) | Ergänzt zu 1% |
| B 27 Zuschlag 10 mL | Ergänzt mit 2% |
| MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x) | Ergänzt mit 1% |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Ergänzt mit 1% |
| 2-Mercaptoethanol 50 mL (1000x ) | Ergänzt um 0,1 % |
