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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von Seziermaterial, Nährmedien, mikrofluidischen Geräten
- Autoklavieren Sie Zange und Schere für die Mikrodissektion (121 °C, Sterilisationszeit: 20 min) und lagern Sie sie in einem sterilen Behälter.
- Sterilisieren Sie die Deckgläser (24 mm x 24 mm), indem Sie sie 24 Stunden lang in 1 M HCl auf einem Orbitalschüttler bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie sie dreimal mit sterilem, destilliertem H2O und dreimal mit Ethanol 99 %. Anschließend trocknen Sie die Deckgläser bei 37 °C oder unter einer sterilen Fließhaube. Zum Schluss autoklavieren Sie die Deckgläser oder setzen sie sie UV-Licht aus (30 Minuten), um die Sterilisation abzuschließen. Deckgläser können dann in Ethanol 70% gelagert werden.
- Nehmen Sie die AXIS Axon Isolationsgeräte vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus der Verpackung und legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
- Mit einem sterilen Biopsiestempel (ø: 1 mm) wird ein Loch pro zu kultivierender Probe erzeugt (Abbildung 1) in Übereinstimmung mit den Kulturkammern.
Anmerkung: Stanzen Sie nicht zu nah an die Mikrorillen, da diese durch den ausgeübten Druck beschädigt werden können.
- Sterilisieren Sie die AXIS Axon Isolationsgeräte, indem Sie sie zu 70 % in Ethanol tauchen. Trocknen Sie dann die AXIS Axon Isolationsgeräte und Deckgläser vollständig unter einer sterilen Durchflusshaube. Warten Sie mindestens 3 Stunden, bevor Sie fortfahren.
Anmerkung: Eine unvollständige Trocknung führt zu einer fehlerhaften Montage der mikrofluidischen Geräte.
- Legen Sie jedes Deckglas in eine 35-mm-Petrischale oder eine Vertiefung innerhalb einer 6-Well-Platte.
- Setzen Sie das AXIS Axon Isolationsgerät auf das Deckglas und drücken Sie es sanft, aber fest mit einer Pinzette mit gebogenen Enden, um eine vollständige Haftung zwischen dem Isolationsgerät und dem Glasdeckglas zu ermöglichen.
- In jede Kulturkammer werden 150 μl Poly-D-Lysin pipettiert (0,1 mg/ml in sterilem, destilliertem H2O). Stellen Sie die mikrofluidischen Geräte 5 Minuten lang unter ein Vakuum, um die gesamte Luft aus den Kulturkammern zu entfernen.
- Wenn noch Luft in den Kammern zu sehen ist, pipettieren Sie die Poly-D-Lysin-Lösung erneut in die Kammern.
- Inkubieren Sie die Geräte mit Poly-D-Lysin O/N bei 37 °C.
- Waschen Sie die Kammern dreimal mit sterilem, destilliertem H2O.
- Die Kammern werden mit 150 μl Laminin-Arbeitslösung (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder serumfreiem Medium) gefüllt und O/N bei 37 °C inkubiert.
- Bereiten Sie 50 ml Medium für Trigeminusganglienkulturen mit folgender Zusammensetzung vor: 48 ml Neurobasalmedium, 1 ml B-27, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 5 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF), 0,25 pM Cytosin-Arabinosid.
- Bereiten Sie 50 ml Medium für Zahnkeimkulturen mit folgender Zusammensetzung vor: 40 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 ml fötales Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 20%), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 150 μg/ml Ascorbinsäure.
>2. Erzeugung und Dissektion von Mausembryonen
- Bestimmen Sie das Embryonalalter anhand des Vaginalpfropfens (Vaginalpfropfen: embryonaler Entwicklungstag 0,5, E0,5) und bestätigen Sie es anhand morphologischer Kriterien. Für dieses Protokoll verwenden wir in der Regel E14.5-E17.5 Mausembryonen.
- Reinigen Sie den Präparierbereich und das Stereoskop mit Ethanol 70%.
- Opfern Sie die schwangere Mutter durch eine Gebärmutterhalsluxation. Positionieren Sie den Hals der Maus zwischen dem ersten und zweiten Finger auf einem Gitter und ziehen Sie den Schwanz entschlossen mit.
- Präparieren Sie die Haut um den Unterbauch und öffnen Sie den Bauch mit einer Schere. Lokalisieren Sie die Gebärmutter: In den späten Stadien der Schwangerschaft füllt die Gebärmutter die Bauchhöhle reichlich aus.
- Präparieren Sie die Gebärmutter und legen Sie sie in eine mit PBS gefüllte Röhre auf Eis. Auf Eis kann das Gewebe mehrere Stunden lang belassen werden. Entsorgen Sie den Leichnam der Mutter gemäß den Richtlinien der Anstalt.
- Präparieren Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und befreien Sie sie von ihrem extraembryonalen Gewebe. Legen Sie die Embryonen in PBS auf Eis.
- Enthaupten Sie die Embryonen mit einer Schere und trennen Sie den Unterkiefer mit einer Mikrodissektionschere vom Rest des Kopfes (Abbildung 2A). Entfernen Sie den Unterkiefer präzise, ohne die Trigeminusganglien zu beschädigen. Da letztere in unmittelbarer Nähe des Unterkiefers lokalisiert sind, ist eine versehentliche Beschädigung möglich. Den Unterkiefer und den Rest des Kopfes in kaltem PBS auf Eis aufbewahren.
- Um Trigeminusganglien (TG) zu präparieren, nehmen Sie den Kopf und legen Sie ihn auf eine Petrischale aus Sezierglas, die zuvor mit kaltem PBS gefüllt war. Entferne mit der Pinzette die Haut und den Schädel. Entfernen Sie dann das Telencephalon und das Kleinhirn, indem Sie eine Pinzette unter das Telencephalon legen und anheben; Das Telencephalon und das Kleinhirn klappen zusammen um, so dass die Unterseite des Schädels freiliegt.
- Lokalisieren Sie die Trigeminusganglien (Abbildung 2B). Trennen Sie den TG mit einer Pinzette von den Trigeminusnerven. Beseitigen Sie die Reste der Trigeminusvorsprünge mit den Präpariernadeln als Messer. Legen Sie das sezierte TG in eine Petrischale, die mit kaltem PBS gefüllt ist, und bewahren Sie es auf Eis auf.
- Um embryonale Zähne zu präparieren, legen Sie den zuvor vom Schädel getrennten Unterkiefer auf die mit kaltem PBS gefüllte Petrischale aus Sezierglas. Entfernen Sie mit Präpariernadeln als Messer die Zunge und die Haut, die den Kiefer umgibt. Trennen Sie den linken und den rechten Halbkiefer, indem Sie entlang der Mittellinie des Kiefers schneiden. Die Zahnkeime sind gut sichtbar, wie in Abbildung 2C dargestellt. Isolieren Sie die Zahnkeime mit Präpariernadeln und entfernen Sie überschüssiges nicht-zahnärztliches Gewebe. Legen Sie die präparierten Zahnkeime in eine mit kaltem PBS gefüllte Petrischale und halten Sie sie auf Eis.
>3. Mikrofluidische Co-Kulturen
- Entfernen Sie nach der Dissektion das Laminin aus den mikrofluidischen Geräten. Füllen Sie die Kammern mit 200 μl des jeweiligen Mediums.
- Übertragen Sie mit einer Pinzette das präparierte TG und die Zahnkeime vorsichtig in die durch das Stanzen entstandenen Löcher (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, dass die Zahnkeime nicht schwimmen und bis zum Kontakt mit den Deckgläsern absinken.
- Die Proben werden in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 kultiviert.
- Wechseln Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden. Entleeren Sie die Kammern nicht vollständig und pipettieren Sie nicht direkt in die Kulturkammern.
Eine vollständige Entleerung der Kammern würde zur Bildung von Luftblasen in den Kammern führen; Ein direktes Pipettieren in die Kammer würde zu axonalen Schäden führen. Um diese Probleme zu vermeiden, entfernen Sie das Medium, indem Sie die Pipette zur Außenseite der Vertiefungen zeigen. Pipettieren Sie das frische Medium auf ähnliche Weise an der Seite der Vertiefungen, die sich gegenüber den Kammern befinden.
- Co-Kulturen können während der Kulturperiode leicht durch Zeitraffermikroskopie abgebildet und über 10 Tage aufrechterhalten werden.
- Waschen Sie die Kammern nach der Kulturperiode, indem Sie 150 μl PBS in eine Vertiefung pro Kammer pipettieren und PBS dreimal durch die Kammern fließen lassen.
- Das PBS wird entfernt und die Proben fixiert, indem 150 μl Paraformaldehyd 4 % (in PBS) in eine Vertiefung pro Kammer pipettiert werden; 15 Minuten lang bei RT inkubieren. Die Kammern werden zweimal mit PBS gewaschen, wie in 3.6 beschrieben.
- Fahren Sie mit der weiteren Analyse fort.
