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$$\longrightharp{xx}$$,
HINWEIS: Abbildung 1A, B zeigt ein Schema des vormontierten zyklischen Olefin-Copolymers (COC)-Chips, einschließlich der Positionen der Hauptkanäle oder -kompartimente, Vertiefungen und Mikrorillen. Der kompartimentierte Chip kann unterschiedliche fluidische Mikroumgebungen innerhalb eines Kompartiments erzeugen, wie die Isolierung von Lebensmittelfarbstoff zeigt (Abbildung 1C).
>1. Beschichtung von Multi-Kompartiment-Chips für hSC-Neuronen
HINWEIS: Abbildung 2A zeigt einen Überblick über die Beschichtungsverfahren.
- Lösen Sie Poly-L-Ornithin in destilliertem Wasser in Zellkulturqualität auf, um 600 μl Lösung pro Chip einer 20 μg/ml-Arbeitslösung herzustellen.
- Aspirieren Sie die verbleibende phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die nach der Vorbereitung der Chips aus den Vertiefungen übrig geblieben ist. Achten Sie beim Aspirieren darauf, dass die Pipettenspitze von der Kanalöffnung entfernt ist.
Anmerkung: Die mikrofluidischen Kanäle müssen während des gesamten Eingriffs gefüllt bleiben. Saugen Sie keine Flüssigkeit aus den Kanälen/Kammern an, sondern nur aus den Vertiefungen.
- 150 μl Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung in die obere rechte Vertiefung geben. Warten Sie 90 Sekunden oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte Vertiefung zu füllen. Geben Sie 150 μl Medium in die untere rechte Vertiefung und warten Sie 5 Minuten, bis die Flüssigkeit durch die Mikrorillen gelangt ist.
- Geben Sie 150 μl Medium in die obere linke Vertiefung. Warten Sie 90 s und geben Sie dann 150 μl in die Vertiefung unten links. Den Halter des/der Chips/Chips/Chips mit Parafilm einwickeln und über Nacht bei 4 °C erhitzen.
Anmerkung: Alternativ können Sie den Chip und den Halter 1 h lang bei 37 °C aufstellen.
- Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen ab und stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze von der Kanalöffnung entfernt ist. Geben Sie 150 μl steriles Wasser in die obere rechte Vertiefung. Warten Sie 90 s und geben Sie dann 150 μl in die untere rechte Vertiefung. Warten Sie 5 Minuten, bis die Flüssigkeit durch die Mikrorillen gelangt ist.
- Geben Sie 150 μl steriles Wasser in die obere linke Vertiefung, warten Sie 90 s und geben Sie dann weitere 150 μl in die untere linke Vertiefung
.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.6.
- Tauen Sie das Laminin langsam bei 2 °C bis 8 °C auf und bereiten Sie eine Arbeitslösung von 10 μg/ml vor.
- Laden Sie 150 μl der Laminin-Arbeitslösung in die obere rechte Vertiefung. Warten Sie 90 Sekunden oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte Vertiefung zu füllen. Pipettieren Sie 150 μl in die untere rechte Vertiefung. Warten Sie 5 Minuten, um das Laminin durch die Mikrorillen laufen zu lassen.
- 150 μl Laminin in die obere linke Vertiefung geben. Warten Sie 90 s und geben Sie dann 150 μl in die Vertiefung unten links. Inkubieren Sie den Chip in seinem Halter 2 Stunden lang bei 37 °C.
- Spülen Sie den Chip mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+). Laden Sie 150 μl PBS in die Vertiefung oben rechts. Warten Sie 90 Sekunden oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte Vertiefung zu füllen. Geben Sie 150 μl PBS in die untere rechte Vertiefung und warten Sie 5 Minuten, bis das PBS durch die Mikrorillen gelangt ist.
- Pipettieren Sie 150 μl PBS in die obere linke Vertiefung. Nach 90 s 150 μL in die untere linke Vertiefung pipettieren.
- Aspirieren Sie PBS aus dem Chip und spülen Sie den Chip dann mit NSC-Medien (siehe Materialtabelle). Laden Sie 150 μl Medium in die Vertiefung oben rechts. Nach 90 s oder wenn die Flüssigkeit durch den rechten Kanal in die untere rechte Vertiefung gelangt, geben Sie 150 μl in die untere rechte Vertiefung. Warten Sie 5 Minuten, bis das Medium durch die Mikrorillen fließen kann.
- Geben Sie 150 μl Medium in die obere linke Vertiefung und weitere 150 μl in die untere linke Vertiefung. Inkubieren Sie den Chip in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2, um den Chip bis zur Aussaat von NSCs vorzukonditionieren.
Anmerkung: Die Chips können bei Bedarf über Nacht vorkonditioniert werden.
>2. Platzieren von NSCs in den Multi-Compartment-Chip
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendete kommerziell gekaufte NSCs, im Gegensatz zu unserer vorherigen Veröffentlichung, die mit menschlichen embryonalen Stammzellen begann. Bei diesem Protokoll werden neurale Stammzellen direkt in die Kunststoffchips plattiert, wo sie sich zu Neuronen differenzieren. Die Zellen können als NSCs (ohne Differenzierung) bis zu 2 Passagen proliferieren und in Fläschchen in flüssigem N2 zur weiteren Verwendung gelagert werden. Dieses Protokoll verwendet NSC-Fläschchen, die nach Passage 1 oder 2 in der Flüssigkeit N2 gelagert wurden. Abbildung 2B zeigt einen Überblick über die Beschichtungsverfahren.
- Tauen Sie NSCs gemäß den Anweisungen des Herstellers auf.
Anmerkung: Dieses Verfahren gilt für von H9 abgeleitete NSCs. Andere Zelllinien erfordern eine Optimierung der Zelldichte.
- Zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und stellen Sie sie mit NSC-Medien ein, um eine Konzentration von 7 x 106 Zellen pro ml zu erhalten.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung des Chips an. Vermeiden Sie das Ansaugen von Medien aus den Hauptkanälen.
- Pipettieren Sie 5 μl der Zelllösung in die obere rechte Vertiefung, gefolgt von 5 μl in die untere rechte Vertiefung (insgesamt 70.000 Zellen). Stellen Sie sicher, dass die Zellen in Richtung der Hauptkanalöffnungen pipettiert werden. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob die Zellen in den Kanal eingedrungen sind. Warten Sie 5 Minuten, bis die Zellen an der Unterseite des Chips haften.
Anmerkung: Eine oder beide Kammern können zum Laden von Zellen verwendet werden.
- Pipettieren Sie ~150 μl NSC-Medium in die obere rechte Vertiefung und dann 150 μl in die untere rechte Vertiefung. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite. Bei 5 % CO2, 37 °C in einem geeigneten befeuchteten Behälter inkubieren.
- Nach 48 Stunden aspirieren Sie NSC-Medien aus den Vertiefungen und ersetzen Sie sie durch neuronale Differenzierungsmedien, indem Sie 150 μl in jede obere und untere Vertiefung geben.
- Kultivieren Sie Neuronen in einem 5 % CO2 , 37 °C -Inkubator in einem geeigneten befeuchteten Behälter.
