$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie eine Gewebedissoziationslösung aus steriler, phenolrothaltiger Dulbecco-Phosphatpuffersalzlösung (DPBS) mit Papain (100 U/ml), Cystein (0,2 mg/ml) und Desoxyribonuklease (DNase, 250 U/ml) vor.
- Zur Herstellung der DNase-Lösung 100 mg des lyophilisierten Pulvers von DNase I (eine Flasche) in 50 ml H2O verdünnen. Gut mischen und die Stammlösung filtrieren. Bereiten Sie 10 ml Stammaliquote vor. Teilen Sie ein Vorratsröhrchen in 0,5 mL Einweg-Aliquots auf. Lagern Sie diese Einmal-Aliquots bei -80 °C.
- Bereiten Sie Reagenzien für die magnetische Trennung vor, indem Sie magnetischen Säulenpuffer X vorbereiten: 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung.
- Zur Herstellung von Neurosphärenmedien verwenden Sie ein neurobasales Medium, das Penicillin/Streptomycin mit L-Glutamin enthält, und ergänzen Sie es mit 2 % B27, 20 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng/ml humanem rekombinantem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
- Zur Herstellung von Differenzierungsmedien verwenden Sie ein neurobasales Medium und ergänzen Sie es mit 10 ng/ml differenziertem Faktor Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-AA) oder 10 ng/ml Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und 2% B27.
- Verwenden Sie 12-Well- (3,5 cm2) und 6-Well-Kulturplatten (9,6 cm2) mit extrem niedrigem Aufsatz.
>2. Sektion des Kleinhirns
- Betäuben Sie Mäusewelpen (P3-P7) mit Isofluran und enthaupten Sie sie mit einer chirurgischen Schere.
- Besprühen Sie die abgetrennten Köpfe der Welpen mit 70% Ethanol.
- Füllen Sie jeden Kopf in eine leere sterile 10-cm-Kulturschale. Trennen Sie die Haut mit einer Mikrodissektionsschere und entfernen Sie dann den Schädel, indem Sie die Schere sagittal entlang der Mittellinie führen.
- Schälen Sie mit der Pinzette #7 die Schädelknochen ab, beginnend mit dem Hirnstamm. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel an, halten Sie das Kleinhirn intakt und geben Sie das Gehirn in eine frische, sterile 10,0-cm-Schale mit 15 ml eiskalter Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS).
- Stellen Sie die Schale, in der sich das Gehirn befindet, unter ein Seziermikroskop. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette #5 die Hirnhäute und großen Blutgefäße aus dem Kleinhirn und trennen Sie das Kleinhirn mit dem Spatel vom Hirnstamm.
- Übertragen Sie das Kleinhirn in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5,0 mL eiskalter HBSS-Lösung. Waschen Sie das Kleinhirn durch Spülen und Dekantieren 3x mit 5,0 mL HBSS.
Anmerkung: Jedes Kleinhirn sollte zur weiteren Verarbeitung in ein eigenes Röhrchen gegeben werden.
>3. Vorbereitung der Zellsuspension
- Stellen Sie die Schale, in der sich das Gehirn befindet, unter ein Seziermikroskop. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette #5 die Hirnhäute und großen Blutgefäße aus dem Kleinhirn und trennen Sie das Kleinhirn mit dem Spatel vom Hirnstamm.
- Übertragen Sie das Kleinhirn in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5,0 mL eiskalter HBSS-Lösung. Waschen Sie das Kleinhirn durch Spülen und Dekantieren 3x mit 5,0 mL HBSS.
Anmerkung: Jedes Kleinhirn sollte zur weiteren Verarbeitung in ein eigenes Röhrchen gegeben werden.
- Nach der letzten Spülung fügen Sie 5 ml Gewebedissoziationslösung auf Papainbasis hinzu, die auf 37 °C vorgewärmt wurde. Inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Wasserbad. Mischen Sie den Inhalt langsam, indem Sie das Röhrchen 3x–5x alle 3 Minuten entweder mit einem Nutationsmischer oder von Hand auf und ab drehen.
- Bereiten Sie eine Pasteurpipette mit großem Durchmesser (normale Glaspipette) und eine Pasteurpipette mit schmalem Durchmesser (feuerpoliert durch Erhitzen über einem Bunsenbrenner) vor, wie zuvor beschrieben.
- Waschen Sie das Tuch 3x mit 5 mL HBSS-Lösung, um einen Verlust des Gewebes beim Dekantieren von Hand zu vermeiden.
- Entfernen Sie die letzte HBSS-Wäsche und geben Sie 5 ml DPBS-Lösung mit 250 μl DNase-Lösung in das Gewebe. Dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie 10-15x mit der Pasteur-Pipette mit großem Durchmesser verreiben. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig aus, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Dann wird die Aufschlämmung weitere 10 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert, wobei das Rohr umgedreht und begradigt wird.
- Verwenden Sie die Pasteur-Pipette mit reduziertem Durchmesser, um die Gewebeaufschlämmung 10x weiter zu zerkleinern. Wenn große Gewebestücke übrig bleiben, drücken Sie die Gewebestücke mit der Spitze der Pipette vorsichtig gegen den Boden des Röhrchens und pipettieren Sie weiter, bis die Zellen eine feine Suspension erreicht haben.
- Inkubieren Sie das Gewebe weitere 10 Minuten bei 37 °C und wiederholen Sie die vorherigen Mischschritte.
>4. Immunmarkierung von Stammzellen
- Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf Eis und verwenden Sie für die nächsten Schritte eiskalte Lösungen. Die dissoziierten Zellen werden durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen abgeseiht. Bedecken Sie den Filter mit 10,0 mL HBSS-Lösung, um sicherzustellen, dass die Zellen in dieser zusätzlichen Lösung durch das Netz gelangen.
- Übertragen Sie die gefilterten Zellen in ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand vollständig, indem Sie vorsichtig einen Vakuumaspirator verwenden.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 160 μl magnetischem Säulenpuffer. Um die Einzelzellsuspension vor der magnetischen Markierung zu erhalten, führen Sie die Zellen durch ein 30 μm Nylonnetz, um Zellklumpen zu entfernen, die sonst die Säule verstopfen könnten.
- Geben Sie 40 μl Anti-Prominin-1-Mikrokügelchen in jedes 15-ml-Röhrchen, mischen Sie es und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Kühlschrank, damit der Antikörper an Prominin-1-exprimierende Zellen binden kann.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1,0–2,0 mL Säulenpuffer X und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 x g. Saugen Sie den Überstand vollständig ab.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1,0 mL Säulenpuffer X.
Anmerkung: Wenn nach der Resuspension des Pellets mit 1,0 mL Säulenpuffer X kleine Klumpen zu sehen sind, sollten diese vorsichtig mit der Spitze der Pasteurpipette entfernt werden, da diese Klumpen sonst die magnetische Säule während der Zellsortierung blockieren können.
>5. Vorbereitung, Zellsortierung und Beschichtung von magnetischen Säulen
HINWEIS: Die magnetische Trennung von verschiedenen Genotyp-Bedingungen (Krankheit vs. Kontrolle) muss gleichzeitig durchgeführt werden, da jede Verzögerung die Morphologie der Neurosphäre beeinflussen kann.
- Bereiten Sie die Magnetsäulen vor, indem Sie sie auf das Magnetstativ stellen, das dem Magnetfeld ausgesetzt ist. Spülen Sie die Säule einmal mit 500 μl Puffer X, indem Sie Puffer auftragen, der in ein Zentrifugenröhrchen tropft, um es zu verwerfen.
Anmerkung: Bereiten Sie für jedes Experiment frischen magnetischen Säulenpuffer X vor; Wenn nicht, dann wird die Stammzellausbeute gering sein.
- Tragen Sie die markierte Zellsuspension auf die Säule auf. Sammeln Sie den Durchfluss mit unmarkierten Zellen, die hauptsächlich aus zerebellären neuronalen/glialen Mischzellen bestehen, in frische 15-ml-Röhrchen (Abbildung 1A).
- Waschen Sie die Säule 3x mit 500 μL Puffer X (jeder Waschgang dauert ca. 2–4 min).
Anmerkung: Zerebelläre neuronale/gliale Mischkulturen, die mit zerebellären granulären Neuronen angereichert sind, können als nützliches Nebenprodukt dieses Reinigungsschritts dienen.
- Nehmen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie 1,0 ml Kulturmedium (Neurosphärenmedium) in die Säule und schieben Sie den Kolben in die Säule, um die mit Prominin-1-Kügelchen markierten Zellen in ein frisches 1,5-ml-Falkenröhrchen auszuspülen.
- Um die Reinheit von Prominin-1-markierten Zellen zu verbessern, führen Sie die eluierten Zellen über eine zweite Säule, indem Sie die Schritte 5.1 bis 5.4 befolgen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die typische Ausbeute beträgt 107 Zellen pro Kleinhirn. Plattieren Sie die Zellen auf Platten mit extrem niedrigem Anheften (6 oder 12 Wells, je nach der für nachgeschaltete Experimente erforderlichen Dichte).
>6. Passage der Neurosphären und Differenzierung
- Plattieren Sie die Prominin-1-markierten Stammzellen auf 12-Well-Platten mit extrem geringer Bindung in Neurosphärenmedium (5.000 Zellen/Well).
- Nach 7–10 Tagen teilen sich die Zellen und bilden kugelförmige schwebende Neurosphären (primäre Neurosphären).
Anmerkung: In diesem Experiment werden sekundäre Neurosphären erzeugt, die sich zahlenmäßig erweitern, für die weitere Verwendung. Primäre Neurosphärenpopulationen werden für diese Experimente nicht verwendet, da sie kontaminierende Zellen enthalten können, die keine Stammzelleigenschaften haben und mit Neurosphären verklumpen können.
- Für die Passage übertragen Sie die primären Neurosphären zusammen mit dem Nährmedium mit 1,0-ml-Pipettenspitzen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Neurosphären werden durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min pelletiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Gewebedissoziationsmedium, das Papain oder 0,05% Trypsinlösung enthält. Bei 37 °C 10 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL Neurosphärenmedium und dissoziieren Sie die Zellen mechanisch mit einer Pasteur-Plastikpipette und pipettieren Sie langsam 10x auf und ab.
- Plattieren Sie die Zellen (wieder) in Neurosphären-Medien, wie zuvor beschrieben. Nach 7–10 Tagen in Kultur sollte die Platte mit sekundären Neurosphären angereichert werden.
Anmerkung: Diese Kulturen können mit guter Effizienz bis zu 8x durchgelassen werden, danach ist die Größe der Neurosphäre tendenziell kleiner und deutet auf eine Abnahme der Proliferation hin.
- Zählen Sie die Zellen auf dem Hämozytometer und der Platte die optimale Anzahl für zukünftige Experimente auf Poly-D-Lysin-beschichteten Platten (6 oder 12 Wells).
- Um die Stammzellen zu differenzieren, sammeln Sie Neurosphären von der zweiten bis zur achten Passage durch Zentrifugation, wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme, dass Sie dem Pellet ein Differenzierungsmedium hinzufügen.
Anmerkung: Nach 7 Tagen in vitro differenzieren sich die Stammzellen in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten, wie die Färbung mit dem neuronalen Marker β-III-Tubulin, dem astrozytären Marker Glial fibrillary acidic protein (GFAP) und dem Oligodendrozytenmarker O4 zeigte.
