Kokulturierung von retinalen Ganglienneuronen mit olfaktorischen Encaping-Gliazellen

Zusammenfassung

Quelle: Portela-Lomba, M., et al. Cokultur von axotomisierten retinalen Ganglienneuronen der Ratte mit olfaktorischer Umhüllung Glia, als In-vitro-Modell der axonalen Regeneration bei Erwachsenen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt das Verfahren, retinale Ganglienneuronen (RGNs) aus der Netzhaut einer Ratte zu isolieren und sie mit olfaktorischen Encascaping-Gliazellen (OEG) zu kokulturieren. Diese Methode ermöglicht es, das neuroregenerative Potenzial von OEGs nach neuronalen Verletzungen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung von ihOEG (Ts12 und Ts14) für den Assay

HINWEIS: Dieser Schritt muss 24 Stunden vor der RGN-Dissektion und Kokultur durchgeführt werden.

1. Deckgläser mit 12 mm Ø mit 10 μg/mL Poly-L-Lysin (PLL) für 1 h.
   behandeln Anmerkung: Die Deckgläser können über Nacht in der PLL-Lösung belassen werden.
2. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
3. Ts12 und Ts14 ihOEG-Zellen aus der p60-Zellkulturschale lösen.
   1. Geben Sie 4 ml DMEM/F12 (Basalmedium)-FBS (fötales Rinderserum) Kulturmedium in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad erwärmen.
   2. Nehmen Sie das Medium von den Platten und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)-EDTA (Ethylendiamin-Tetraessigsäure).
   3. 1 ml Trypsin-EDTA in die OEG-Zellen geben und 3–5 min bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
   4. Die Zellen werden mit einer p1000-Pipette entnommen und auf das in Schritt 2.1 vorbereitete Medium umgefüllt.
   5. 5 min bei 200 x g zentrifugieren.
   6. Aspiriere den Überstand.
   7. Fügen Sie 1 ml ME10-Medium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.
   8. Zählen Sie die Zellzahl in einem Hämozytometer.
4. 80.000 Ts14-Zellen oder 100.000 Ts12-Zellen/Well in 24-Well-Platten mit 500 μl ME10-Medium auf die Deckgläser säen.
5. Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ für 24 h kultivieren.

>2. Dissektion von Netzhautgewebe

HINWEIS: 2 Monate alte männliche Wistar-Ratten werden als RGN-Quelle verwendet. Zwei Netzhäute (eine Ratte) für 20 Vertiefungen einer 24-Well-Zellschale. Autoklavieren Sie chirurgisches Material vor dem Gebrauch. Das Papain-Dissoziationskit ist im Handel erhältlich (Materialtabelle). Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters für die Rekonstitution. D, L-2-amino-5-phosphonovaleriansäure (APV) in 5 mM Stamm rekonstituieren und die Aliquote vorbereiten.

1. Bereiten Sie am Tag des Assays die folgenden Medien vor.
   1. Bereiten Sie eine p60-Zellkulturschale mit 5 ml kaltem EBSS (Earle's balanced salt solution) vor (Fläschchen 1 des Papain-Dissoziationskits).
   2. Bereiten Sie eine p60-Zellkulturschale mit rekonstituiertem Fläschchen 2 (Papain) des Papain-Dissoziationskits plus 50 μl APV vor. Fügen Sie dann 250 μl rekonstituiertes Fläschchen 3 (DNase plus 5 μl APV) hinzu.
   3. Mischen Sie in einem sterilen Röhrchen 2,7 ml Durchstechflasche 1 mit 300 μl Durchstechflasche 4 (Albumin-Ovomucoid-Protease-Inhibitor). Fügen Sie 150 μl Fläschchen 3 (DNase) plus 30 μl APV hinzu.
   4. Bereiten Sie 20 ml Neurobasal-B27-Medium (NB-B27) vor.
2. Opfere eine Ratte durch Ersticken mit CO₂.
3. Entfernen Sie den Kopf durch Enthauptung mit einer Guillotine, legen Sie ihn in eine 100-mm-Petrischale und besprühen Sie den Kopf zu 70 % mit Ethanol, bevor Sie ihn in eine Laminar-Flow-Haube legen.
4. Schneide die Schnurrhaare der Ratte mit einer Schere ab, damit sie die Augenmanipulation nicht beeinträchtigen.
5. Fassen Sie den Sehnerv mit einer Zange, um den Augapfel so weit herauszuziehen, dass Sie mit einem Skalpell einen Schnitt quer durch das Auge machen können.
6. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper und ziehen Sie die Netzhaut (orangefarbenes Gewebe) heraus, während die restlichen Schichten des Auges (einschließlich der Pigmentepithelschicht) im Inneren bleiben.
7. Legen Sie die Netzhaut in die in Schritt 2.1.1 vorbereitete p60-Zellkulturschale.
8. Übertragen Sie die Netzhaut in die in Schritt 2.1.2 vorbereitete p60-Zellkulturschale und schneiden Sie sie mit dem Skalpell in kleine Stücke von ungefähr < 1 mm.
9. In ein 15-ml-Kunststoffröhrchen umfüllen.
10. Inkubieren Sie das Gewebe 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ und rühren Sie alle 10 Minuten.
11. Dissoziieren Sie Zellklumpen, indem Sie mit einer Pasteur-Glaspipette auf und ab pipettieren.
12. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min.
13. Entsorgen Sie den Überstand. Um Papain zu inaktivieren, resuspendieren Sie das Zellpellet in der in Schritt 2.1.3 hergestellten Lösung (1,5 ml für 2 Augen).
14. Pipettieren Sie diese Zellsuspension vorsichtig in 5 ml der rekonstituierten Durchstechflasche 4.
15. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
16. Entfernen Sie während des Zentrifugierens das ME-10-Medium vollständig von der OEG 24-Well-Zellplatte (zuvor in Schritt 1 vorbereitet) und ersetzen Sie es durch 500 μl NB-B27-Medium pro Well.
17. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml NB-B27-Medium.
18. Platte 100 μl retinale Zellsuspension, pro Vertiefung der m24-Platte, auf PLL-behandelte oder OEG-Monolayer-Deckgläser.
19. Die Kulturen werden 96 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ in NB-B27-Medium gehalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
B-27 Zuschlag	Gibco	17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleriansäure	Sigma	283967	NMDA-Rezeptor-Inhibitor
DMEM-F12	Gibco	11320033	Zellkulturmedium
FBS	Gibco	11573397	Fötales Rinderserum
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Fötales Rinderserum
L-Glutamin	Lonza	BE17-605F
Neurobasales Medium	Gibco	21103049	Kulturmedium für neuronale Zellen
Papain-Dissoziationssystem	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Für den Einsatz bei der Isolierung von neuralen Zellen
Pbs	Hausgemacht
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E	Bakteriostatisch und bakterizid
Hypophysen-Extrakt	Gibco	13028014	Rinder-Hypophysen-Extrakt
Poly-L-Lysin (PLL)	Sigma	A-003-M