Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Extrazelluläre Matrix-Gelflecken
- Führen Sie einen Tag vor der Isolierung die folgenden Schritte aus:
- Ein Aliquot des extrazellulären Matrixgels (100 μl) bei 4 °C für mindestens 1,5 Std. Auftauen 1:10 in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium; mit 4.500 mg/L Glucose, 4 mM L-Glutamin und 110 mg/ml Natriumpyruvat (DMEM). Halten Sie das Gel der extrazellulären Matrix immer bei 4 °C.
HINWEIS: Abrupte Temperaturänderungen führen zu einer ungleichmäßigen Beschichtung und Kristallbildung.
- Bewahren Sie die verdünnte extrazelluläre Matrix-Gellösung 15 Minuten lang auf Eis auf.
- Eine 20-μl-Mikropipette 10 Minuten lang vorkühlen.
- Legen Sie die Objektträger mit 8 Vertiefungen in eine 100-mm-Petrischale und stellen Sie die Schale für 10 Minuten auf eine kalte Oberfläche (z. B. einen Gefrierpack).
- Verwenden Sie die vorgekühlte Mikropipette, um einen Tropfen 10 μl extrazelluläres Matrixgel in jede Vertiefung zu geben. Halten Sie die Petrischale mindestens weitere 7 Minuten auf der kalten Oberfläche (Abbildung 1A).
- Entfernen Sie das restliche extrazelluläre Matrixgel vollständig (Abbildung 1B) und trocknen Sie die Vertiefungen über Nacht bei 37 °C.
>2. Dissektion der Kopfmuskulatur (Masseter, Digastric und Levator veli palatini)
- Bereiten Sie vor der Dissektion 50 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, die mit 2 % Penicillin-Streptomycin (P/S) ergänzt wird. Bleiben Sie auf Eis.
- Nach der Euthanasie einer jungen erwachsenen Ratte (9 Wochen) mit CO2/O2 ist der Kopf zu enthaupten und die Haut vom Kopf zu entfernen. Den Kopf in eiskaltes PBS, ergänzt mit 2% P/S, in einer 50 ml Tube umfüllen.
- Kaumuskel (aus dem 1. Kiemenbogen abgeleitet)
- Legen Sie den Kopf mit einer Seite nach oben auf ein Silikonpad und fixieren Sie ihn mit Injektionsnadeln (Abbildung 2A).
- Identifizieren Sie die Ohrspeicheldrüse und den Gesichtsnerv (Abbildung 2A). Lege die tiefe Faszie frei, die die Drüse bedeckt. Schneiden Sie die Faszie ab und entfernen Sie die Drüse mit einer Präparierschere. Identifiziere den äußeren Gehörgang. Verfolgen Sie den Gesichtsnerv vom Foramen stylomastoideus und entfernen Sie vorsichtig die Schläfen-, Jochbein- und Wangenäste mit einem Skalpell Nr. 15.
- Befreien Sie den oberflächlichen Kopf des Kaumuskels, indem Sie die Faszien entfernen. Identifizieren Sie sowohl oberflächliche als auch tiefe Köpfe des Kaumuskels. Verfolgen Sie den oberflächlichen Kopf, bis seine dicke sehnenartige Aponeurose in den Jochbeinfortsatz des Oberkiefers eingeführt wird.
- Trennen Sie die Sehne von ihrem Ursprung am Jochbeinfortsatz mit einer geraden Pinzette. Schneiden Sie es mit einer Skalpellklinge Nr. 15 oder einer Präparierschere ab und heben Sie es vorsichtig an (Abbildung 2B).
- Präparieren Sie den oberflächlichen Kopf des Kaumuskels mit einer Skalpellklinge Nr. 15 bis zu seinem Einstich in den Winkel und die untere Hälfte der lateralen Fläche des Ramus des Unterkiefers (Abbildung 2C). Entferne nun den Muskel vollständig.
- Hinterer Bauch des Musculus digastricus (abgeleitet vom 2. Kiemenbogen)
- Legen Sie den Kopf in Rückenlage auf das Silikonpad und fixieren Sie ihn mit Injektionsnadeln (Abbildung 3A).
- Entfernen Sie das subkutane Fett, das sowohl über den sublingualen als auch über den submandibulären Drüsen liegt. Entfernen Sie anschließend die oberflächlichen Faszien und Drüsen mit einer Präparierschere. Legen Sie den Digastricus-Muskel (vorderer und hinterer Bauch) frei.
- Halten Sie die vordere Sehne des hinteren Bauches mit einer geraden Pinzette fest, schneiden Sie sie ab und präparieren Sie sie vorsichtig, bis ihr Ursprung in der Paukenblase liegt (Abbildung 3B). Machen Sie dasselbe auf der kontralateralen Seite.
- Musculus levator veli palatini (aus dem 4. Kiemenbogen gewonnen)
- Nach der Dissektion des hinteren Bauches des Musculus digastricus lokalisieren Sie den Musculus stylohyoideus, ziehen ihn seitlich und entfernen ihn vorsichtig (Abbildung 4A).
- Lokalisieren Sie die Sehne des Levator veli palatini, die an der Trommelfellbulla ansetzt (Abbildung 4A). Präparieren Sie es vorsichtig und schneiden Sie es auf beiden Seiten ein.
- Achte auf die Luftröhre und die Speiseröhre, die dahinter verläuft. Heben Sie die Speiseröhre an und legen Sie den Rachen und den Kehlkopf frei.
- Lokalisieren und präparieren Sie den Bereich des Musculus pharyngeus constrictor superior. Den Levator veli palatini identifizieren und an beiden Seiten einschneiden (Abbildung 4B).
Anmerkung: Direkt nach der Dissektion wird unter dem Stereomikroskop vorsichtig Sehnen und Bindegewebe von jedem Muskel entfernt. Tauchen Sie alle Proben schnell in 70%iges Ethanol und überführen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen mit eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% P/S.
>3. Isolierung von Satellitenzellen (SCs)
- Führen Sie die folgenden Vorbereitungsschritte für die SC-Isolierung aus den drei Muskelgruppen durch:
- Bereiten Sie 7,5 ml 0,1% Pronase in DMEM vor. Die Lösung durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Die Lösung vor der Isolierung 10 Minuten lang bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.
- Bereiten Sie 35 ml DMEM vor, ergänzt mit 10 % Pferdeserum (HS) und 1 % P/S. Außerdem bei 37 °C im Wasserbad vorwärmen.
- Bereiten Sie 15 ml Kulturmedium vor, das aus DMEM besteht, das mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS), 10 % HS, 1 % P/S und 1 % Hühnerembryoextrakt (CEE) ergänzt wird. Bei 37 °C im Wasserbad vorwärmen.
- Sechs Kunststoffpipetten (10 ml) mit HS vorbeschichten und vor Gebrauch mindestens 10 min trocknen lassen.
- Übertragen Sie jeden Muskel in der Kulturhaube in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Schneide den Muskel mit der Präparierschere in kleine Stücke von ca. 2 mm. Achten Sie darauf, das Taschentuch nicht zu sehr zu zerkleinern.
- Geben Sie vorsichtig 2,5 ml 0,1%ige Pronaselösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 °C. Schütteln Sie die Platte nach 20, 40 und 60 Minuten vorsichtig.
Anmerkung: Die genaue Dauer der Inkubation hängt von Faktoren wie dem Alter und dem Stamm der Tiere ab.
- Monitor unter dem Mikroskop. Kontrollieren Sie die Muskelfragmente und stoppen Sie die enzymatische Verdauung, wenn die Faserbündel gelockert erscheinen (Abbildung 5).
- 2,5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % HS und 1 % P/S. In ein 15 ml Röhrchen umfüllen und die Röhrchen bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand durch Dekantieren verwerfen.
- Fügen Sie 5 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % HS und 1 % P/S. Pipettieren Sie die Lösung mit einer 10 ml Kunststoffpipette (Verreibung) mindestens 20 Mal auf und ab, um das Gewebe zu homogenisieren.
- Die Röhrchen bei 200 x g 4 min zentrifugieren. Den Überstand auffangen und in ein 15 ml Röhrchen umfüllen.
- Fügen Sie 5 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % HS und 1 % P/S. Pipettieren Sie erneut mit einer 10 ml Kunststoffpipette, bis die Gewebefragmente leicht passieren.
- Die Röhrchen bei 200 x g für 4 min zentrifugieren und den Überstand in einem 15 ml Röhrchen auffangen.
- Geben Sie ein Zellsieb (40 μm) auf ein 50-ml-Röhrchen und überführen Sie den Überstand mit den dissoziierten Zellen auf den Filter. Mit 1 ml DMEM waschen, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl Kulturmedium und zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer.
>4. Differenzierung von Satellitenzellen auf extrazellulären Matrix-Gelspots
- Die Zellsuspension wird verdünnt, um 1,5 x 103 Zellen in 10 μl Kulturmedium zu erhalten.
- Befestigen Sie die Abdeckungen der Kammerdias mit Klebeband und markieren Sie die Stellen mit einem schwarzen Marker auf der Unterseite des Objektglases.
- Geben Sie mit einer Mikropipette einen Tropfen mit 10 μl Zellsuspension auf den Gelspot der extrazellulären Matrix. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob der Tropfen der Zellsuspension an Ort und Stelle richtig platziert wurde. Sechs Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Vorsichtig werden 400 μl Nährmedium (DMEM ergänzt mit 20 % FBS, 10 % HS, 1 % P/S und 1 % CEE) zugegeben und drei Tage lang bei 37 °C inkubiert><.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sind frisch isolierte SC einem massiven Trauma ausgesetzt (enzymatischer Verdau und starke Verreibung) und müssen sich erholen. Stören Sie die Zellen in den ersten drei Tagen nicht. Anschließend kann das Nährmedium je nach Art des Experiments gewechselt werden.
Die extrazellulären Matrix-Gel-Spots können mit einer hohen Zelldichte (1,5-2,5 x 103/20 μl) für den Differenzierungsassay besiedelt werden. Das Nährmedium (DMEM, ergänzt mit 20 % FBS, 10 % HS, 1 % P/S und 1 % Hühnerembryoextrakt) kann jeden dritten Tag ausgetauscht werden.
