Retinsäure-induzierte Neurogenese anhand embryonaler Karzinomzellen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Leszczyński, P., et al., Neurogenese unter Verwendung von p19 embryonalen Karzinomzellen J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt eine einfache Technik zur Retinsäure-induzierten Neurogenese in embryonalen P19-Karzinomzellen der Maus. Retinsäure aktiviert Transkriptionsfaktoren und löst die Genexpression für die neuronale Differenzierung aus.

Protokoll

>1. Erzeugung von Aggregaten

1. 5 μl RA (Retinsäure) (1 mM Stamm, gelöst in 99,8 % Ethanol, gelagert bei -20 °C) zu den 10 ml Differenzierungsmedium geben und gut mischen (Endkonzentration von 0,5 μM RA).
   Anmerkung: RA ist lichtempfindlich. Eine niedrige Konzentration von Ethanol hat keinen Einfluss auf die Zelldifferenzierung.
2. Geben Sie 10 ml Differenzierungsmedium (mit RA) in die unbehandelte 100-mm-Kulturschale (für die Suspensionskultur).
3. Die 1 x 10⁶ Zellen in die 100 mm Schale (Schalenoberfläche 56,5 cm2) aussäen.
4. Der Kolben mit den Zellen wird 2 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in den Inkubator gestellt, um die Aggregatbildung zu fördern.
5. Tauschen Sie nach 2 Tagen das Differenzierungsmedium aus. Medium, das Aggregate enthält, mit einer 10-ml-Pipette aspirieren und bei RT in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
6. Lassen Sie die Zuschlagstoffe 1,5 min lang bei RT durch die Schwerkraft absetzen.
7. Entsorgen Sie den Überstand.
8. Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette frische 10 ml Differenzierungsmedium mit 0,5 μM RA hinzu.
   Vorsicht: Pipettieren Sie die Zellaggregate nicht auf und ab.
9. Die Zuschlagstoffe werden in eine neue, unbehandelte 100-mm-Kulturschale (speziell für die Suspensionskultur) ausgesät.
10. Legen Sie die Platte für 2 Tage in den Inkubator (bei 37 °C und 5 % CO₂).

>2. Dissoziation von Aggregaten

1. Aspirieren Sie die Zellaggregate mit einer 10-ml-Pipette.
2. Übertragen Sie die Aggregate in ein 15-ml-Röhrchen. Lassen Sie die Zellaggregate 1,5 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen.
3. Entfernen Sie den Überstand.
4. Waschen Sie die Aggregate nur mit DMEM (serum- und antibiotikafrei).
5. Lassen Sie die Zellaggregate durch Schwerkraftsedimentation 1,5 min bei RT absetzen.
6. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%) hinzu.
7. Legen Sie die Zellaggregate für 10 min in ein Wasserbad (37 °C). Rühren Sie die Aggregate alle 2 min vorsichtig durch Klopfen mit der Hand um.
8. Stoppen Sie den Trypsinisierungsprozess, indem Sie 4 ml Erhaltungsmedium hinzufügen.
9. Pipettieren Sie die Aggregate 20 Mal mit einer 1-ml-Pipette auf und ab.
10. Zellen für 5 min bei 200 x g und RT zentrifugieren.
11. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Erhaltungsmedium.
12. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Zellzähler.

>3. Zellen plattieren

1. Geben Sie 3 ml Erhaltungsmedium pro Well in eine 6-Well-Platte.
2. Keimzellen in der 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 0,5 x 10⁶/Well.
3. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO_{2 -}Konzentration.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM hoher Glukosespiegel (4,5 g/L) mit L-Glutamin	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99,8 %	Chempur	CHEM*613964202
Fötales Rinderserum (FBS)	EUR x	Nr. E5050-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x konzentriert ohne Calcium- und Magnesiumionen	Lonza	BE17- 517Q
Retinsäure	Sigma- Aldrich	Nr. R2625-50MG	Gelöst in 99,8 % Ethanol; bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern
Trypsin 0,25% - EDTA in HBSS, ohne Calcium- und Magnesiumionen, mit Phenolrot	Bioseren	LM-T1720/500
1 mL Serologische Pipetten	Profilab	515.01
10 mL Serologische Pipetten	Profilab	515,1
100-mm-Schale für die Suspensionskultur	Corning	C351029
15 mL Zentrifugenröhrchen	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serologische Pipetten	Profilab	Artikel-Nr.: 515,05
6-Well-Platte	Corning	CLS3516
Zellkulturflaschen, Oberfläche 25 cm im Quadrat	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA

kg kg kg