Differenzierung embryoider Körperzellen in neurale Vorläuferzellen mit Hilfe von Retinsäure

Zusammenfassung

Quelle: Yang, J., et al. Analyse der Retinsäure-induzierten neuronalen Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei- und dreidimensionalen embryonalen Körpern. J. vis. exp. (2017).

Das Video demonstriert die Methode zur Induktion der Stammzelldifferenzierung in neuronale Vorläuferzellen mit Retinsäure und der Methode der hängenden Tropfenkultur.

Protokoll

>1. Kultur von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus

1. Bereiten Sie MEF-Medium zu, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, hoher Glukosegehalt), ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum (FBS).
2. 100 mm Zellkulturschalen 30 min lang bei Raumtemperatur (RT) mit 0,5%iger Gelatinelösung bestreichen.
3. Zählen Sie MEFs mit einem Zytometer. Entfernen Sie die Gelatinelösung und gießen Sie sofort auf 37 °C vorgewärmtes MEF-Medium ein. Fläschchen mit Mitomycin C-behandelten MEFs in einem 37 °C Wasserbad 2 Minuten lang schnell auftauen, dann 2,8 x 10⁶ MEFs pro 100 mm gelatinebeschichteter Schale aussäen. Passen Sie die Zellzahl entsprechend an, wenn Sie Schalen anderer Größe verwenden. Inkubieren Sie MEFs über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂.
4. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag. 2-3 Tage lang kultivieren, bis die MEF-Schicht konfluent ist.

>2. Embryonale Stammzell- oder ESC-Kultur der Maus

1. Bereiten Sie das ESC-Medium, das modifizierte Dulbecco-Medium (IMDM) von Iscove, ergänzt mit 15 % FBS und 10³ U/ml-Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 55 mM 2-Mercaptoethanol, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), Gentamicin (200 μg/ml) und 0,2 % Mykoplasmen-Antibiotikum vor.
2. Nehmen Sie das in Schritt 1 zubereitete Gericht aus dem MEF-Medium und ersetzen Sie es durch 37 °C vorgewärmtes ESC-Medium.
3. Tauen Sie ein ESC-Fläschchen und die Seed-Zellen auf der MEF-Schicht auf. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO₂, bis die ESCs den Zusammenfluss erreichen.
4. Bereiten Sie neue Zellkulturschalen vor, die eine konfluente Monoschicht aus MEFs enthalten. Um die ESCs zu passieren, einmal mit PBS waschen und mit 0,25 % Trypsin/EDTA für 2-5 min bei 37 °C, 5 % CO₂ lösen. Stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie frisches IMDM mit 15 % FBS zu den ablösenden Zellen hinzufügen, die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und bei 160 x g für 5 min bei RT zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die ES-Zellen mit frischem IMDM und passieren Sie ein Fünftel der Zellen in jede neue MEF-beschichtete Schale; inkubieren Sie, bis die Zellen die Konfluenz erreichen (typischerweise 4-5 Tage).

>3. Entnahme von MEFs und Kultur-ESCs auf gelatinebeschichteten Platten

1. Sobald die ECS die Konfluenz erreicht haben, lösen Sie sie und MEFs mit 0,25 % Trypsin/EDTA wie in Schritt 2.4 ab, resuspendieren Sie die Zellen in frischem IMDM, überführen Sie sie in eine nicht-adhäsive bakteriologische Petrischale und inkubieren Sie 40 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO₂.
2. Übertragen Sie ESCs und MEFs-haltiges Medium vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette auf eine neue, mit Gelatine beschichtete Platte, um wiederholtes Pipettieren zu vermeiden. Die in den Petrischalen verbleibenden Zellen sind MEFs, da ESCs nicht anhaften.
3. Durchlaufen Sie die ESCs alle 3-4 Tage. Eine weniger häufige Passage kann die ESC-Pluripotenz verringern. Überschreiten Sie nicht 60% Konfluenz, da dies die Differenzierung begünstigen kann.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.3 je nach Bedarf dreimal, bis die MEFs mit einem 20-fachen Objektiv nicht mehr durch ein Zellkulturmikroskop nachweisbar sind, um sicherzustellen, dass keine MEFs vorhanden sind.
5. Überprüfen Sie die ESC-Pluripotenz, indem Sie die ESC-Kultur überprüfen, um festzustellen, ob die Zellen dichte Kolonien mit typischer polygonaler ESC-Morphologie bilden (Abbildung 1A). Testen Sie die Zellstammzellen durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), Immunblotting oder Immunfluoreszenz von Kernpluripotenz-Transkriptionsfaktoren (Abbildung 2).

>4. EB-Bildung

1. Bereiten Sie eine all-trans-RA-Stammlösung bei 10 mM in DMSO vor und aliquotieren Sie sie in lichtgeschützte 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen. Die Lösung ist bei -80 °C bis zu zwei Wochen stabil. Schützen Sie es vor Licht.
2. Trypsinisieren Sie ESCs wie in Schritt 2.4; replatieren Sie frisches IMDM ohne LIF als einzellige Suspension.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine 5 x 10⁵ Zellen/ml-Suspension in IMDM mit 0,5 μM RA vor.
4. Plattieren Sie 100 20-μl-Tropfen pro 100-mm-Petrischale mit einer 8-Kanal-Pipette und 200-μl-Spitzen, drehen Sie die Schalen um und füllen Sie den umgekehrten Deckel mit PBS, um ein Austrocknen der hängenden Tropfen zu verhindern. Schützen Sie RA-haltige Nährmedien vor Licht.
5. Kultivieren Sie EBs 4 Tage lang in hängenden Tropfen bei 37 °C, 5 % CO₂.

Ergebnisse

Abbildung 1: Sprossenentstehung aus Syx^+/+ und Syx^-/- EBS in der 3D-Kultur. (A) Syx^+//+ und Syx^-/- ESCs wuchsen in geclusterten Kolonien, bevor die neuronale Differenzierung induziert wurde. (B und C) Bilder von EBs, die in hängenden Tropfen mit 0,5 μM RA gebildet und dann in eine 3D-Kollagenmatrix ohne RA eingefügt wurden. Die Bilder wurden an Tag 6 mit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC-Zuführschicht
Esc	EMD Millipore	CMTI-2
Zellkulturschale (60 mm)	Eppendorf	30701119	Zellkultur
Zellkulturschale (100 mm)	Falke	353003	Zellkultur
Petrischale (100 mm)	Corning	351029	Hängende Tropfen
Dunkles 1,5 ml Zentrifugenröhrchen	Celltreat Scientific Produkte	229437	RA-Stammlösung
Mikroskop-Deckglas	Fisherbrand	Tel.: 12-545-80	Rund, 12 mm Durchmesser
Superfrost-plus Objektträger	Fisherbrand	Artikel-Nr.: 12-550-15
reagenzien
DMEM	Lonza	12-709F	MEF-Kultur
IMDM	Gibco	Tel.: 12440-046	ESCs-Kultur
Fötales Rinderserum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs-Kultur
Gelatine	Sigma-Aldrich	Nr. G2625	Beschichtung der Schüssel
Lif	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 8878-LF-025	Zur Aufrechterhaltung der ESC-Pluripotenz
MEM Lösungen für nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140050	Zellkultur
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Zellkultur
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Zellkultur
gentamicin	Gibco	15750060	Zellkultur
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Zellkultur
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	Tel.: 25200-072	Zellkultur
Dmso	Sigma-Aldrich	Nr. D2650
All-trans-Retinsäure	Sigma-Aldrich	Nr. R2625-50MG	Induktion der neuronalen Differenzierung
Pbs	Gibco	10010049
Instrumente
Weitfeld-Mikroskop	Nikon	Eclipse TS100	Bildgebung von Zellkulturen