>1. Klonierung des 2K7 Lentivectors
- Bevor Sie das interessierende Gen in den lentiviralen 2K7-Vektor klonieren, subklonieren Sie das Gen in den pENTR-Vektor (3637 bp, Kanamycin-resistent) unter Verwendung molekularer Standardtechniken. Verwenden Sie die EcoRI- und SacII-Restriktionsstellen für die Subklonierung.
- Amplifikation des 2K7 Lentivector
- Transformieren Sie die 2K7-Lentivektor-DNA, indem Sie 100 ng Plasmid-DNA vorsichtig mit kompetenten Zellen mischen und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.
- Hitzeschock-DNA/kompetente Zellen mischen sich bei 42 °C für 90 Sekunden und plattieren sie auf LB-Agar-Platten, die sowohl Ampicillin (100 μg/ml) als auch Chloramphenicol (15 μg/ml) bei 37 °C für 16-18 Std. enthalten
HINWEIS: Chloramphenicol wird verwendet, um eine Rekombination zwischen den langen terminalen Wiederholungen zu verhindern.
- Züchten Sie am nächsten Tag ausgewählte bakterielle Klone in Luria-Bertani (LB)-Medien, die sowohl Ampicillin (100 μg/ml) als auch Chloramphenicol (15 μg/ml) enthalten, bei 37 °C für 16-18 Stunden. Extrahieren Sie die DNA mit einem kommerziellen Plasmid-DNA-Maxiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Subklonierung vom pENTR-Vektor zum 2K7-Lentivektor (Abbildung 1).
- In ein 1,5-ml-Röhrchen geben: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (Promotor) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (mit Gen of interest) (80 bng)1-2,5 μl K7-Lentivektor (80 ng/μl)1 μl TE-Puffer, pH 82-5 μl.Insgesamt 8 μl.
- Nehmen Sie die Klonase-Enzymmischung bei -80 °C und tauen Sie sie 2 Minuten lang auf Eis auf. Stellen Sie sicher, dass dieses Enzym ein frisches Aliquot von -80 °C ist, da das Enzym die Klonierungseffizienz bei wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen erheblich verringert hat
- Fügen Sie 2 μl Enzym pro Reaktion hinzu und mischen Sie es gut über den Vortex und inkubieren Sie das Klonase-Reaktionsgemisch bei 23-25 °C für 6-24 Stunden.
- 1 μl Proteinase-K-Lösung (im Lieferumfang des Enzymkits enthalten) zum Klonase-Reaktionsgemisch geben und 10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
- Wandeln Sie das Klonase-Reaktionsgemisch in kompetente Zellen um und züchten Sie die ausgewählten Kolonien in LB-Medien, die Ampicillin (100 μg/ml) enthalten, bei 37 °C für 16-18 Stunden.
- Extrahieren und reinigen Sie DNA mit einem kommerziellen Plasmid-DNA-Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Die DNA wird durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Spe I und Sac II und einem geeigneten Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers bestätigt, um das Fragment zu entfernen, das den Promotor und das Gen von Interesse enthält.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um zu überprüfen, ob die subklonierte DNA das richtige Insert-Gen von Interesse mit dem richtigen Vektorrückgrat aufweist. Die Größe des Vektors selbst ohne das eingefügte Fragment beträgt 6,7 kb. Die Größe des freigesetzten insertionierten Fragments umfasst sowohl den Promotor als auch das Insertionsgen von Interesse. Berechnen Sie die erwarteten Fragmentgrößen aus dem Verdau für das spezifische Gen über ein DNA-Sequenz-Bearbeitungsprogramm, z. B. APE-A Plasmid Editor.
- Überprüfen Sie die Größe sowohl des DNA-Vektor-Rückgrats als auch des freigesetzten Fragments, indem Sie ein 1%iges Agarosegel in 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle 1) bei 100 V laufen lassen.
- Amplifizieren Sie die bestätigte DNA, indem Sie Bakterien in 500 ml LB-Medien mit Ampicillin (100 μg/ml) bei 37 °C für 16-18 Stunden züchten.
- Extrahieren und reinigen Sie DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA-Maxiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkung: Maxiprep erzeugt in der Regel eine ausreichende Menge an DNA, die für die Virusproduktion erforderlich ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.9 bis 1.3.10, um die folgenden DNAs für lentivirale Präparate zu amplifizieren: Hüllvektor (PMD2. G, 6.1 kb), Package-Vektor (pBR8.91, 12.5 kb) und ein leerer lentiviraler Vektor als Kontrolle (GFP-CMV-2K7, 8.7 kb).
>2. Produktion von 2K7-Viren
HINWEIS: Tag 1:
- Am Tag der Transfektion werden 32 Millionen HEK293 T-Zellen in einem T175-Kolben mit 25 ml 293 T-Zellmedien der menschlichen embryonalen Niere (HEK) erfasst (siehe Tabelle 1). Alternativ können 16 Millionen Zellen am Tag vor der Transfektion beschichtet werden, wenn die Zeit am Tag der Transfektion knapp wird.
Anmerkung: Die Transfektion kann ebenso erfolgreich sein, indem Zellen am Tag der Transfektion oder vor dem Tag der Transfektion plattiert werden. Bei einer der beiden Alternativen besteht der entscheidende Punkt darin, sicherzustellen, dass die Zellen vor der Transfektion auf der Oberfläche der Kulturschale festsitzen.
Anmerkung: Tag 2:
- Transfektion
- Vor der Transfektion verdünnen Sie die DNA auf 1 μg/μl in Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (TE)-Puffer, der 10 mM Tris pH 8 und 1 mM EDTA pH 8 in deionisiertem Wasser enthält.
- In einem 50-ml-Röhrchen wird ein Mastermix (Tabelle 2) für die Transfektion im Kolben T175 hergestellt. Geben Sie DNA zu vorgewärmtem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und mischen Sie es gut durch Vortexen, dann fügen Sie steriles Polyethylenimin (PEI) hinzu (siehe Tabelle 1, um vorzeitige Ausfällungen zu vermeiden).
- Gut mischen, indem das Röhrchen 3-4x umgedreht und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert wird.
- Führen Sie einen vollständigen Medienwechsel an HEK293T Zellen durch. Das Kulturmedium wird vollständig von den Zellen abgesaugt und mit vorgewärmtem HEK293T Zellkulturmedium (25 ml pro T175-Kolben) gefüttert.
- Geben Sie das Transfektionsgemisch (DNA/PEI-Gemisch) tropfenweise zu den Monolayer-Zellen. Vorsichtig mischen, und die transfizierten Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
HINWEIS: Tag 3:
- Um sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich ist, überprüfen Sie die Expression des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) 24 Stunden nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Anmerkung: Über 50% der Zellen, die GFP exprimieren, weisen typischerweise auf eine gute Transfektion hin.
Anmerkung: Tag 4:
- 48 Stunden nach der Transfektion ist der Virusüberstand zu entnehmen und durch frisches HEK293 T-Medium (25 ml pro T175-Kolben) zu ersetzen.
- Zentrifugieren Sie den Virusüberstand bei 1.140 x g für 10 min bei 4 °C, um Zelltrümmer aus dem Überstand zu entfernen. Der gereinigte Überstand wird in ein 50-ml-Röhrchen umgefüllt und bei 4 °C gelagert.
HINWEIS: Tag 5:
- 72 Stunden nach der Transfektion ist die zweite Charge des Virusüberstands zu entnehmen. Schritt 2.3.1 wiederholen und die gereinigten Überstände 48 und 72 Stunden poolen.
- Um das Virus zu konzentrieren, zentrifugieren Sie den Virusüberstand bei 170.000 x g für 90 min bei 4 °C mit 30-ml-Ultrazentrifugenröhrchen.
- Der Überstand wird verworfen und Schritt 2.6 wiederholt, bis der gesamte gereinigte Überstand zentrifugiert wurde, wobei ein (unsichtbares) Pellet aus Virus und ausgefälltem PEI im Boden des Röhrchens verbleibt.
- Um das Virus zu resuspendieren, geben Sie 500 μl SATO-Medien (siehe Tabelle 1) in die Ultrazentrifugenröhrchen. 30 Sekunden lang vortexen und mit einer Pipettenspitze den Boden des Röhrchens abkratzen, um das Virus mechanisch zu lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x, um das Viruspellet zu verlieren.
- Füllen Sie das resuspendierte Virus in Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie es sehr kurz, um unlösliches PEI zu entfernen. Filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,45-μm-Filter, um Proteine zu entfernen.
- Aliquotieren Sie das Virus in 20 μl, 50 μl und 100 μl Aliquote und lagern Sie es bei -80 °C.
>3. Übertragen von OPCs
- Kulturieren Sie primäre OPCs in SATO-Medien (10 ml/10 cm Platte) mit ziliärem neurotrophem Faktor (CNTF, 10 ng/ml), Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF, 10 ng/ml), Neurotrophin 3 (NT3, 1 ng/ml) und Forskolin (4,2 μg/ml) bei 37 °C, 8 % CO2 für 24 Stunden nach der Dissektion
.
- Saugen Sie die OPC-Kulturmedien vollständig ab und füttern Sie die Zellen mit frisch hergestellten SATO-Medien (10 ml) mit Wachstumsfaktoren (siehe oben in Schritt 3.1).
- Geben Sie Viren in der optimalen Konzentration zu den OPCs und kultivieren Sie die OPCs für weitere 48 Stunden.
>4. OPC-Seeding für myelinisierende Co-Kulturen (Abbildung 2)
- Um OPCs von der Oberfläche zu entfernen, spülen Sie zuerst die OPC-Platten zweimal mit 8 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) aus und inkubieren Sie die Zellen dann mit 5 ml warmem 0,05%igem Trypsin-EDTA, verdünnt 1:10 mit EBSS bei 37 °C für 2 min.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit 30% FBS in EBSS (5 ml) und entfernen Sie die Zellen durch Pipettieren von der Platte. Die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und bei 180 x g für 15 min bei RT zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vorgewärmtem SATO-Medium, gefolgt von der Zellzählung.
- Vor der OPC-Aussaat wird das Medium vollständig von der DRG-Kulturplatte abgesaugt. Säen Sie vorsichtig 200.000 OPCs tropfenweise auf die DRG-Neuronen auf, wie zuvor beschrieben.
Anmerkung: Das Gesamtvolumen der OPC-Aussaat muss weniger als 200 μl pro 22-mm-Deckglas betragen.
- Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang in der Gewebekulturhaube absetzen, ohne die Platte zu bewegen, und füllen Sie sie dann vorsichtig mit 1 ml vorgewärmtem SATO-Medium pro Vertiefung auf.
- Beschichten Sie die verbleibenden Schwester-OPCs mit SATO-Medien mit Wachstumsfaktoren (siehe Schritt 6.1). Verwenden Sie diese Schwester-OPCs, um die Expression des interessierenden Proteins zu überprüfen.
- Ersetzen Sie nach 24 Stunden das SATO-Medium durch das Co-Kulturmedium (2 ml/Well), das SATO-Medien (keine Faktoren) und neurobasale Medien (v/v) mit 1 % B2 enthält. Bewahren Sie die Co-Kulturen 14 Tage lang auf, wobei das Medium alle 2-3 Tage gewechselt wird.
- Beurteilen Sie die Co-Kulturen für die Myelinproteinexpression durch Western-Blot-Analyse und visualisieren Sie die Bildung myelinisierter axonaler Segmente durch Doppelimmunfärbung mit Antikörpern gegen Myelin-Basisproteinmarker und neuronale Marker.
