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Methodenartikel

Ein in vitro Transduktions-induzierter Myelinisierungsassay für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

857 Aufrufe

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Peckham, H. M., et al. Produktion und Verwendung von Lentiviren zur selektiven Transduktion von primären Oligodendrozyten-Vorläuferzellen für In-vitro-Myelinisierungsassays. J. Vis. Exp. (2015).

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Oligodendrozyten und zur Induktion der Myelinisierung in einer Co-Kultur mit Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG). Die OPCs werden mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für ein Signalprotein kodieren, das die Myelinisierung reguliert. Die transduzierten OPCs werden mit DRG-Neuronen co-kultiviert, um die Differenzierung in Oligodendrozyten und die Signalprotein-induzierte Myelinisierung zu beurteilen.

Protokoll

>1. Klonierung des 2K7 Lentivectors

  1. Bevor Sie das interessierende Gen in den lentiviralen 2K7-Vektor klonieren, subklonieren Sie das Gen in den pENTR-Vektor (3637 bp, Kanamycin-resistent) unter Verwendung molekularer Standardtechniken. Verwenden Sie die EcoRI- und SacII-Restriktionsstellen für die Subklonierung.
  2. Amplifikation des 2K7 Lentivector
    1. Transformieren Sie die 2K7-Lentivektor-DNA, indem Sie 100 ng Plasmid-DNA vorsichtig mit kompetenten Zellen mischen und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.
    2. Hitzeschock-DNA/kompetente Zellen mischen sich bei 42 °C für 90 Sekunden und plattieren sie auf LB-Agar-Platten,....

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Ergebnisse

Tabelle 1. Tabelle der Stammlösungen.

NameZutatenNotizen
TE Puffer pH 810 mM Tris pH 8
1 mM EDTA pH 8
Schminke dich in entionisiertem Wasser.
Polyethylenimin (PEI)1 g/LIn entionisiertem Wasser auffüllen,.......

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2K7 LentivektorFreundliches Geschenk von Dr. Suter
5-Fluor-2′-desoxyuridinSigma-AldrichNr. F0503-100mg
ampicillinSigma-AldrichNr. A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronale ErgänzungTechnologien für StammzellenNr. 5711
BDNF (Mensch)PeprotechPT450021000
Biotin (d-Biotin)Sigma-AldrichNr. B4639
BsaSigma-AldrichNr. A4161
ChloramphenicolSigma-AldrichNr. C0378-100G
CNTFPeprotechTel.: 450-13020
DAKO Fluoreszenz-EindeckmedienDAKOS302380-2
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein GlutaminLebenstechnologien10313039
DNaseSigma-AldrichD5025-375KU
DPBS (Englisch)Lebenstechnologien14190250
DPBS, Kalzium, MagnesiumLebenstechnologien14040182
EBSSLebenstechnologien14155063
EcoRI-HFSchnabelNr. R3101
Eintrittsvektoren für Promotor und Gen von InteresseGenerieren gemäß den Protokollen 1-2
Fötales RinderserumSigma-AldrichNr. 12003C
ForskolinSigma-AldrichF6886-50MG
Glukose (D-Glukose)Sigma-AldrichNr. G7528
GlycerinChem VersorgungGL010-500MSiehe Lagerlösungen

Tags

Lentivirale TransduktionNeuronen der SpinalganglienZelldifferenzierungTrypsin-EDTA-BehandlungZentrifugationsprotokollSATO-MedienkulturGFP-KontrollvirusMyelinscheidenbildung