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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Manuelles Sortieren von fluoreszenzmarkierten Mausneuronen
- Ziehen Sie die Glasmikrokapillaren (siehe Materialtabelle) mit einem Kapillarabzieher auf einen Austrittsdurchmesser von 10–15 μm mit folgenden Einstellungen: Wärme: 508, Zug: blank, vel: blank, Zeit: blank.
- Befestigen Sie einen 120–150 cm langen flexiblen Silikonschlauch (~0,8 mm Innendurchmesser) mit geeigneten Schlauchanschlüssen an einem 0,2 μm Membranspritzenfilter aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) und einem Zweiwege-Schlauchventil.
- Bereiten Sie 500 ml gekühlte (4 °C) künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, Tabelle 1) vor und sauerstoffreichen Sie sie an, indem Sie 15 Minuten lang oder bis die Lösung vollständig geklärt ist, 5 % Kohlendioxid-ausgeglichenen Sauerstoff durch einen Ausströmer sprudeln lassen.
- Bereiten Sie 100 ml ACSF mit einem Cocktail aus Aktivitätsblockern in einem 150-ml-Becherglas vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie 100 ml ACSF mit 1 mg/ml Streptokokkenfraktion i.v. Protease in einem 150-ml-Becherglas vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie 100 ml ACSF mit 1 % fötaler Rinderserumlösung (FBS) in einem 150 ml-Becherglas vor und sauerstoffisieren Sie mit 5 % Kohlendioxid ausgeglichenem Sauerstoff durch einen Ausströmer.
- Sezieren Sie das Gehirn einer euthanasierten Maus, indem Sie den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und das frische Gehirn mit einer feinen Pinzette herausziehen, ohne die Hirnrinde zu beschädigen.
Anmerkung: Mäuse jeder Sorte, Alters und Geschlechts können nach Belieben verwendet werden. Frieren Sie das Gehirn nicht ein und führen Sie keine manuelle Sortierung bei Mäusen durch, denen Viren oder andere gefährliche/infektiöse Erreger injiziert wurden.
- Halten Sie das Gehirn in gekühltem und sauerstoffreichem ACSF und lassen Sie während der gesamten Dauer des Schnitts einen Luftstein mit 5 % Kohlendioxid-Gleichgewichtssauerstoff haften.
- Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratogrammfutter und schneiden Sie koronale oder sagittale Schnitte bei 300 μm Dicke. Sammeln Sie so viele Schnitte wie nötig, um mindestens ~10–50 markierte Zellen bis zu mehreren hundert Zellen zu erhalten. Legen Sie die Scheiben auf einen Scheibenhalter aus Baumwollnetz, der in ein Becherglas gelegt wird, so dass sie in sauerstoffreichem ACSF gebadet sind.
- Frische Scheiben in ein Becherglas geben, das ACSF mit Aktivitätsblockern enthält, und 15–20 Minuten bei Raumtemperatur blockieren. Lassen Sie weiterhin Sauerstoff mit Ausströmerstein sprudeln.
- Bringen Sie die Scheiben in ein Becherglas, das ACSF mit der Proteaselösung enthält, um eine milde Verdauung bei Raumtemperatur durchzuführen: 20–30 Minuten für P4-14-Tiere oder bis zu 45–60 Minuten für P28-56-Tiere. Lassen Sie weiterhin Sauerstoff sprudeln.
- Waschen Sie ACSF mit Protease aus, indem Sie die Scheiben zurück in das Becherglas mit der Lösung für Aktivitätsblocker für 5–10 Minuten bei Raumtemperatur zurückschieben. Lassen Sie weiterhin Sauerstoff sprudeln.
- Bringen Sie die einzelnen Abschnitte bei Raumtemperatur in eine 100-mm-Petrischale, die ACSF mit 1 % FBS enthält. Bei einer Fluoreszenzdissektion werden Bereiche und Schichten von Interesse mit mindestens 10 bis 50 Zellen (bis zu einigen hundert) mikrodisseziert. Führen Sie die Mikrodissektion mit einer feinen Pinzette durch oder indem Sie 22–28 G Injektionsnadeln an Holzhaltern (Spießen) befestigen.
- Bewegen Sie die mikropräparierten Stücke mit einer Pasteurpipette in ein 2-ml-Mikrofuge-Röhrchen mit ~0,8 ml 1% FBS in ACSF-Lösung.
- Zerreiben Sie das präparierte Gewebe im Mikrofuge-Röhrchen bei Raumtemperatur. Stellen Sie drei langstielige Pasteur-Pipetten mit abnehmenden Austrittsdurchmessern her, indem Sie sie über eine offene Flamme rollen. Führen Sie mit jeder Pipette ~10 Hübe aus, beginnend mit dem größten und endend mit dem kleinsten.
- Geben Sie die dissoziierten Zellen in eine 100 mm Petrischale, die sauerstoffhaltiges ACSF enthält (die Petrischale kann auf Wunsch dünn mit 5 mm 1% Agar oder klarer Silikonverbindung im Verhältnis 1:10 beschichtet werden). Bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Warten Sie ~5-7 Minuten, bis sich die Zellen allmählich beruhigt haben, und beobachten Sie dann das GFP/RFP-Signal unter einem Präpariermikroskop.
Anmerkung: Einzelne Zellen, Ablagerungen und kleine Klumpen sind im Hellfeld (BF) sichtbar.
- Entnehmen Sie jeweils 10–15 GFP/RFP-Zellen mit einer Kapillarpipette (aus Schritt 1.1), die an einem flexiblen Silikonschlauch (0,4–0,8 mm Innendurchmesser) befestigt ist, und geben Sie die Zellen in eine 100-mm-Petrischale mit frischem, sauerstoffreichem ACSF.
- Indem Sie das Ende des Schlauchventils mit der Zunge blockieren, positionieren Sie die Kapillare in der Nähe der gewünschten Zelle. Erfassen Sie Zellen mit Kapillarwirkung, wenn Sie die Blockade lösen, und blockieren Sie sie schnell wieder, um zu verhindern, dass überschüssige Flüssigkeit in die Pipette gelangt. Geben Sie die Zellen durch sanftes Blasen auf eine 100-mm-Petrischale mit frischem sauerstoffhaltigem ACSF, während Sie die Kapillarspitze unter der Fluoreszenzoptik des Dissektionsmikroskops beobachten. Ziel ist es, insgesamt ~100–150 Zellen zu sammeln.
- Wiederholen Sie Schritt 1.19 noch einmal oder zweimal (je nach Schmutz) und übertragen Sie insgesamt ~50–75 Zellen in eine neue 100-mm-Petrischale, wobei Sie sicherstellen, dass Verunreinigungen wie Ablagerungen in DIC-Optiken (Brightfield Differential Interference Contrast) minimal sind.
Tabelle 1: Liste der Lösungen und Puffer.
kg
| Puffer | Artikel | Konzentration | Menge (μL) |
| Puffer für die Probenentnahme | Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor | | 55 |
| Rcc | 1:50K verwässert | Nr. 110 |
| Nukleasefreies Wasser | | 605 |
| Aliquotieren Sie 43,75 μl davon in 16 Röhrchen (2 Streifen à 8; 200 μl PCR-Röhrchen); fügen Sie Folgendes pro Röhrchen hinzu |
| UMI-Primer (z.B. N10B1-N10B16) | 1 ng/μL | 6,25 μl/Röhrchen |
| Endvolumen in jedem Röhrchen 50 μl (jedes Röhrchen kann in 25 μl Aliquots aufgeteilt und bei -80 °C eingefroren werden) |
| Lösungen: | Artikel | Konzentration | Menge |
| Liquor: um 5 L aufzulösen | NaCl | 126 mM | 36,8 Gramm |
| Kcl | 3 mM | ca. 1,15 g |
| NaH2PO4 | ca. 1,25 Mio. | 0,75 Gramm |
| NaHCO3 | ca. 20 mM | 8,4 g |
| Zu 500 ml ACSF, sauerstoff 10-15 Minuten lang blasen lassen und dann jedes Mal folgenden frischen Sauerstoff hinzufügen: |
| D-Glukose | ca. 20 mM | ca. 1,8 g |
| MgSO4 | ca. 2 mM | 0,5 mL ab 4 M Lager |
| CaCl2 | ca. 2 mM | 0,5 mL ab 4 M Lager |
| Halten Sie ACSF durchgehend mit Sauerstoff versorgt |
| Lösungen: | Artikel | Konzentration |
| Aktivitätsblocker-Cocktail: Machen Sie eine 100-fache Aktie |
| Zu 100 mL ACSF hinzufügen | | |
| APV | 0,05 Mio. | |
| CNQX | 0,02 Mio. | |
| TTX | 0,0001 mM (0,1 μM) |
| Lösungen: | Artikel | Menge | |
| Protease-Soltion (100 mL) | Protease aus Streptomyces griseus | 100 mg | |
| Fötales Rinderserum: kommerzielle Quelle, aliquot in 500 μL für jede Anwendung. |