$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Zellernte und -kultur der OL-Linie (OL)
HINWEIS: Diese Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Am Tag nach dem Schütteln das Bottenstein-Sato (BS) Medium gemäß Tabelle 1 zubereiten.
- Spülen Sie beschichtete Petrischalen 3 Mal mit sterilem destilliertem Wasser aus.
- Der Überstand der Kolben, der hauptsächlich Zellen der OL-Linie, aber auch einige Mikrogliazellen enthält, wird entnommen und auf unbeschichtete 100-mm-Petrischalen aufgebracht.
Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von Mikrogliazellen durch differentiell schnelle Adhäsion auf der Oberfläche der Schale.
- Inkubieren Sie die Petrischalen für 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Jeder T150-Kolben wird mit 25 ml warmem, frisch zubereitetem Nährmedium befüllt und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2 bis zum zweiten Schütteln inkubiert.
- Übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue, unbeschichtete 100-mm-Petrischale, um die Adhäsion der verbleibenden Mikrogliazellen zu ermöglichen.
- Inkubieren Sie die Petrischalen für 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2.
- Entfernen Sie den Überstand, der nicht adhärente Zellen der OL-Linie enthält, und überführen Sie ihn in 50-ml-Röhrchen (Überstand aus 2 Petrischalen für ein 50-ml-Röhrchen). Entsorgen Sie Petrischalen mit Mikroglia.
- Den Überstand 5 min lang bei 423 x g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 mL BS-Medium. Bündeln Sie alle Pellets in einem gemeinsamen 50-ml-Röhrchen und stellen Sie das Volumen auf 10 mL mit BS-Medium ein.
- Bestimmen Sie die Zelldichte, indem Sie Zellen unter dem Mikroskop zählen.
Anmerkung: Es sollte eine Zelldichte zwischen 3 x 105 Zellen/ml und 5 x 105 Zellen/ml erhalten werden.
- Fügen Sie 20 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte größer oder gleich 4 x 105 Zellen/ml ist, um ein Endvolumen von 30 ml zu erhalten, oder fügen Sie nur 10 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte weniger als 4 x 105 Zellen/ml beträgt, um ein Endvolumen von 20 ml zu erhalten.
- Platten Sie zwei oder drei vorbeschichtete 100-mm-Petrischalen mit 10 mL Zellsuspension. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie die Petrischalen von den Ablagerungen, indem Sie 2 Stunden später das gesamte BS-Medium auffrischen.
Anmerkung: Untersuchen Sie die Kultur vor und nach der Reinigung unter dem Mikroskop, um die Zelldichte und die Effizienz der Entfernung von Ablagerungen zu überprüfen.
- 2 Tage lang in BS-Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2,
Anmerkung: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Der Zusammenfluss sollte 70 % bis 80 % betragen.
>2. OCM-Produktion
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durch.
- NB-B27low medium gemäß Tabelle 2 zubereiten.
- Erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 ml warmem NB-B27low-Medium. 2 Tage lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.
- Ernten Sie das OCM, d.h. den Überstand, der OL-sezernierte Faktoren enthält. Sterilisieren Sie OCM mit einem 0,22-μm-Filter.
Anmerkung: Lagern Sie OCM bei 4 °C für maximal 2 Monate.
Tabelle 1: Vorbereitung von Bottenstein-Sato (BS) Medien.
| Bottenstein-Sato (BS) Medien | Endkonzentration |
| Dulbecco's Modifizierter Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
| Apo-Transferrin Mensch | 100 μg/ml |
| BSA (Rinderserumalbumin) | 100 μg/ml |
| Insulin | 5 μg/ml |
| PDGF | 10 ng/ml |
| Progesteron | 62 ng/ml |
| Putrescin-Dihydrochlorid | 16 μg/ml |
| Natriumselenit | 40 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz) | 30 ng/ml |
| T4 (L-Thyroxin) | 40 ng/ml |
Tabelle 2: Vorbereitung der NB-B27low und NB-B27 Medien.
| NB-B27 geringe Medien | Endkonzentration |
| Neurobasal | |
| B27 Beilage | 0,5-fach |
| L-Glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
| NB-B27 Medien | Endkonzentration |
| Neurobasal | |
| B27 Beilage | 1x |
| L-Glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |