- Kompartimentierte Kultur von Spinalwurzelganglien (DRGs), Oligodendrozyten (OPCs) und hGCs (humane Gliomzellen)
>1. Zubereitung von unterteilten Kulturschalen
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in den Tagen vor der geplanten Ernte der DRGs durch.
- Bauen Sie unterteilte Kulturschalen zusammen.
- Kollagen-Stammlösung auf 500 μg/ml in steril destilliertem H2O verdünnen und gründlich mischen.
- Füllen Sie mit einer sterilen Transferpipette eine 35-mm-Kulturschale mit 2 ml Kollagenlösung. Entfernen Sie die Lösung, lassen Sie einen dünnen Kollagenfilm zurück, und geben Sie sie in die nächste 35-mm-Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang und fügen Sie bei Bedarf mehr Kollagenlösung hinzu, bis alle Schalen bedeckt sind.
- Sobald alle Platten beschichtet sind, legen Sie die Platten in eine 245 mm x 245 mm große Kulturschale und legen Sie drei 1 mm x 1 mm große Mullpads in die Mitte der Schale.
- Um das Kollagen zu polymerisieren, befeuchten Sie die Mullpads mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid und decken Sie die Schalen 15 Minuten lang ab.
- Entfernen Sie die Mullpads und lassen Sie das 35-mm-Geschirr in der Laminar-Flow-Haube trocknen.
- Während das Geschirr trocknet, befüllen Sie den Zylinder des Spritzenfettapplikators mit Hochvakuumfett. Legen Sie die Kammern in eine große Medienflasche, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist. Beides durch Autoklavieren sterilisieren und abkühlen lassen.
- Feilen Sie die Spitze einer 18-G-Nadel ab, um eine stumpfe Spitze zu erhalten. In 70% Ethanol sterilisieren. Befestigen Sie die Nadel an der Fettspritze.
- Sterilisieren Sie den Stiftrechen, indem Sie ihn in 70 % Ethanol einweichen. Lassen Sie ihn in der Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
- Nehmen Sie den Deckel von einer trockenen, kollagenbeschichteten 35-mm-Schale. Halten Sie die Schüssel zwischen Daumen und Zeigefinger. Halten Sie mit der anderen Hand den Pin-Rake fest. Üben Sie einen festen Druck aus, um sogar 200 μM breite Kratzer in der Mitte der Schale zu erzeugen.
- Geben Sie mit einer Weidepipette zwei Tropfen Supplementiertes Neuronales Basalmedium in die Mitte der Kratzer.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.11, bis alle Schalen zerkratzt sind.
- Trocknen Sie die unterteilten Kammern in einer Laminar-Flow-Haube.
- Fassen Sie mit einer sterilen hämostatischen Pinzette eine unterteilte Kammer an der mittleren Trennwand. Drehen Sie die hämostatische Pinzette so, dass der Boden der Kammer nach oben zeigt.
- Tragen Sie Silikonfett auf die unterteilte Kammer auf, beginnend nach oben. Achten Sie darauf, dass das Fett ordentlich platziert ist und an allen Ecken überlappt.
- Entfernen Sie den Deckel von einer 35-mm-Schale. Drehen Sie die Schale um und legen Sie die Kratzer über die Kammer. Klopfen Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf den Boden der Platte.
- Drehen Sie die Platte vorsichtig mit der hämostatischen Pinzette um. Lassen Sie die Pinzette los.
- Lege einen Haufen Fett auf den Boden des mittleren Fachs. Füllen Sie jede Kammer mit supplementiertem neuronalem Basalmedium (NB) und prüfen Sie, ob es undicht ist. Versiegeln Sie Leckagen bei Bedarf mit Silikonfett.
- Fahren Sie mit dem Zusammenbau aller Kulturschalen fort und lagern Sie sie über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2.
