Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von Lösungen und Materialien
- Bereiten Sie die Ringer-Lösung vor, indem Sie 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 und 0,147 mM KH2PO4 mischen (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und sterilisieren Sie es in 100-ml-Flaschen. An einem sauberen, trockenen Ort lagern. Waschen Sie Flaschen nicht mit Seife (als Gewebekulturglas behandeln).
- Bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösung Fibronektin (FN) vor (siehe Materialtabelle), indem Sie FN in steriler Ringer-Lösung auflösen und in 100 μl Aliquoten bei -80 °C lagern (mindestens 4 Jahre haltbar).
- Bereiten Sie einen vollständigen Nährboden vor, indem Sie L15-Medien mit 0,8 % L-Glutamin, 0,08 % Penicillin/Streptomycin, 10 % FBS und 10 % Hühnerembryoextrakt ergänzen. Erstellen Sie 3 mL Aliquots und lagern Sie sie bei -20 °C oder -80 °C.
Anmerkung: Werden Kulturen in einem CO2 -Inkubator inkubiert, muss das für Luft gepufferte L15 von Dulbecco Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12) substituiert werden.
- Bereiten Sie Stützrahmen für Filterpapier vor (ca. 1 cm x 1,5 cm große Rechtecke aus Papier mit zwei oder drei gestanzten Löchern, die sich auf der Längsachse überlappen).
- Stanzen Sie mit einem Standard-Dreilocher Löcher entlang der Kante eines großen Stücks Filterpapier, schneiden/schneiden Sie die gestanzte Kante in einen Streifen und schneiden Sie dann den Streifen zwischen den Löchern in Rechtecke mit einer Länge von ~ 1,5 cm. Autoklavieren Sie die Filterpapiere vor dem Gebrauch (optional).
- Sammeln Sie Sezierwerkzeuge, darunter feine Pinzetten (#5), stumpfe Pinzetten, Präparierscheren, Federscheren und geschärfte Wolframnadeln.
>2. Zubereitung von Kulturgerichten
- Wählen Sie für die nachgelagerte Anwendung geeignete Kulturschalen für die neuronale Faltung aus (siehe Materialtabelle).
- Für Kulturen, die fixiert und gefärbt werden sollen, verwenden Sie Glasdeckgläser, die in Multi-Well-Gewebekulturschalen eingelegt werden.
Anmerkung: Deckgläser, die der Vertiefungsgröße entsprechen, bewegen sich beim Mischen mit Flüssigkeit weniger, wodurch sich die Explantate weniger wahrscheinlich verschieben und eher am Deckglas als am Boden der Schale haften.
- Wählen Sie Einkammerschalen mit Glasboden oder geteilte Kammerschalen (siehe Materialtabelle) für die Live-Bildgebung mit einem inversen Mikroskop.
- Verwenden Sie für die Live-Bildgebung an einem aufrechten oder Stereomikroskop optisch geeignete 6-, 12- oder 24-Well-Gewebekulturplatten.
- Ausgewählte Gewebekulturschalen aus Kunststoff für die Massenentnahme von wandernden Neuralleistenzellen für Hochdurchsatzanalysen.
- Geben Sie 10 μl/ml Penicillin und 10 μg/ml Streptomycin in eine 100 ml-Flasche sterile Ringer-Lösung (z. B. 100 μl 10.000 μl/ml Penicillin und 10.000 μg/ml Streptomycin, um Ringer-P/S herzustellen). Verwenden Sie Ringer's P/S innerhalb von 1 Woche.
- Tauen Sie ein Aliquot von 1 mg/ml FN auf Eis auf. Mit Ringer's P/S auf eine Konzentration von 10-100 μg/mL FN verdünnen.
- Pipettieren Sie so viel FN-Lösung, dass der Boden der Vertiefung oder Schale bedeckt ist. Zum Beispiel 100 μl pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte, 500 μl für eine 35-mm-Schale.
- Setzen Sie den Deckel wieder auf und inkubieren Sie Schalen oder Teller mit FN-Lösung in einem befeuchteten Inkubator (oder einem abgedeckten Tablett mit destillierten, in Wasser getränkten Papiertüchern) bei 38 °C (100 °F) für mindestens 1 Stunde, während Sie die Neuralfalten präparieren.
>3. Neuronale Falten sezieren
- Übertragen Sie einen Embryo in eine saubere Schüssel mit Ringers P/S-Lösung und spülen Sie den Embryo ab, indem Sie den Filterpapierrahmen mit einer Pinzette festhalten und vorsichtig hin und her schwenken, um jegliches Eigelb zu entfernen, das die Sicht auf den Embryo verdeckt. Tauschen Sie das P/S des Ringers aus oder geben Sie es in ein frisches Gericht, wenn es trüb wird.
- Positionieren Sie den Embryo mit der Rücken-/Rahmenseite nach oben unter einem Präpariermikroskop. Lassen Sie den Embryo auf dem Papierrahmen, um ihn gespannt und an Ort und Stelle zu halten, und entfernen Sie die Vitellinmembran mit einer Pinzette, um die Neuralfalten freizulegen.
Anmerkung: Wenn der Embryo vom Papierrahmen fällt, kann er flach in der Schale ausgelegt oder zum Sezieren an eine mit Schaum beschichtete Schale gesteckt werden.
- Schneiden Sie mit einer Federschere oder einer geschärften Wolframnadel vorsichtig die Neuralfalten des Mittelhirns heraus. Beziehen Sie das Gewebe kaudal zu den expandierenden optischen Vesikeln und rostral zum Hinterhirn ein, wo Rhombiomerverengungen gerade erst auftreten (die Herzsichel ist auch ein nützlicher Indikator, Abbildung 1B, C). Es ist darauf zu achten, dass der dorsale Aspekt der Neuralfalte mit minimaler Kontamination des Neuralrohrs und des nicht-neuralen Ektoderms herausgeschnitten wird (Abbildung 1C).
- Übertragen Sie die Neuralfalten mit einem P20-Pipettier oder einer sterilen Pasteur-Glaspipette, die mit Dotter-Ringer-P/S gespült wurde, in eine saubere Schale mit Ringer-P/S (dies blockiert den Kunststoff oder das Glas, um ein Anhaften des Gewebes zu verhindern). Bewahren Sie gesammelte Falten auf Eis auf, während Sie weitere Falten zerlegen.
>4. Neuralfalten plattieren
- Tauen Sie ein Aliquot des vollständigen Nährmediums auf (Abschnitt 1, Schritt 3). 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin zugeben und mit dem Filter sterilisieren. Halten Sie das vorbereitete Medium bei 37-38 °C, während Sie andere Schritte ausführen.
- Kulturschalen aus dem Brutkasten nehmen (Abschnitt 2, Schritt 5). Entfernen Sie die FN-Lösung mit einer Pipette oder einer Pasteurpipette aus Deckgläsern, Schalen oder Vertiefungen. Nachdem Sie das FN-beschichtete Substrat mit Ringer's P/S gespült haben, geben Sie ein entsprechendes Volumen an vollständigem Nährmedium in die Schalen oder Vertiefungen (500 μl für Vertiefungen in einer 24-Well-Platte, 2 mL für eine 35-mm-Schale oder eine Sechs-Well-Platte).
Anmerkung: Kleinere Volumina können teure Reagenzien konservieren (z. B. nur 200 μl für eine 24-Well-Platte), stellen aber sicher, dass die Schale ausreichend befeuchtet wird, um eine Verdunstung zu vermeiden.
- Spülen Sie zunächst mit einer p20- oder p200-Pipette die Pipettenspitze mit Dotter Ringer's P/S ab, um den Kunststoff zu blockieren und ein Anhaften des Gewebes zu verhindern. Übertragen Sie dann die isolierten Neuralfalten auf die FN-beschichteten Deckgläser und achten Sie darauf, so wenig Ringer's P/S wie möglich zu übertragen. Platzieren Sie die Falte(n) in der Mitte des FN-beschichteten Deckglases.
Anmerkung: Eine oder mehrere Neuralfalten können auf einem 12 mm Deckglas in einer 19 mm Vertiefung plattiert werden, bis zu 50 auf einer 35 mm Platte.
- Nachdem Sie die Explantate 10-15 Minuten lang ruhen gelassen haben, legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 38 °C (100 °F), indem Sie die Kulturschalen mit plattierten Neuralfalten langsam und vorsichtig tragen. Dadurch wird die Verschiebung von Neuralfalten in den Vertiefungen minimiert und sichergestellt, dass sie dispergiert bleiben und auf allen Deckgläsern haften.
Anmerkung: Bei Verwendung von L15 (nicht DMEM) können Explantatkulturschalen auch in einem Ei-Inkubator inkubiert werden, wobei eine abgedeckte Schale mit angefeuchteten Papiertüchern verwendet wird.
- Inkubieren Sie Neuralfaltenkulturen im befeuchteten Inkubator für die Dauer der aktiven Migration (insgesamt ca. 16-20 Stunden, Abbildung 2).
