Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitungen
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Lösungen und Werkzeuge können weit im Voraus erstellt und am Tag der Präparierung und Aufzeichnung verwendet werden.
- Bereiten Sie das Liebovitz-Medium vor, das mit 10 mM HEPES (L-15-Lösung) ergänzt wird. Die folgenden Schritte beschreiben die Herstellung von 1 l L-15-Lösung.
- 990 ml entionisiertes H2O werden in ein Becherglas gegeben. Messen Sie 2,386 g (10 mM) HEPES und fügen Sie es hinzu. Fügen Sie eine Flasche mit 1 l L-15-Lösungspulver hinzu.
HINWEIS: Pulverförmiges L-15 hat eine längere Haltbarkeit und nimmt weniger Lagerplatz ein. Alternativ können Sie auch L-15-Lösung kaufen und mit HEPES ergänzen. Bei letzterer Option besteht auch die Möglichkeit, eine phenolfreie Lösung zu verwenden, die für die Fluoreszenzbildgebung nützlich ist.
- Rühre die Lösung auf einer Rührplatte um. Fügen Sie mit einem pH-Messgerät langsam 1 N Natriumhydroxid (NaOH) hinzu, um einen pH-Wert zwischen 7,34 und 7,36 zu erhalten.
- Fügen Sie deionisiertes H2O hinzu, bis die Lösung ein Volumen von 1.000 ml erreicht. Filtrieren Sie die Lösung mit einer Membran mit einer Porengröße von 0,22 μm.
Anmerkung: L-15 Lösung kann 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Bei Verwendung von L-15 mit Phenolrot färbt sich die Lösung rosa, wenn sie zu basisch ist (pH > 7,4) oder orange, wenn sie zu sauer ist (pH < 7,34).
- Bereiten Sie das Kulturmedium für die Neuronen der vestibulären Ganglien (VGNs) vor. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um 50 ml Nährmedium herzustellen:
- Geben Sie 47,5 ml GluMAX-I Minimum Essential Medium in ein sauberes Becherglas.
- Messen Sie 0,1194 g (10 mM) HEPES und fügen Sie es hinzu. Dieser zusätzliche Puffer widersteht pH-Änderungen, während sich die Zellen absetzen, bevor sie in den Inkubator gebracht werden.
- Fügen Sie 2,5 ml fötales Rinderserum (FBS) hinzu. Dies macht 5 Vol.-% FBS bei einem Gesamtvolumen von 50 mL Medium.
- Rühre die Lösung auf einer Rührplatte um. Fügen Sie mit einem pH-Messgerät langsam 1 N NaOH hinzu, um einen pH-Wert zwischen 7,38 und 7,4 zu erhalten.
- Fügen Sie 0,5 ml Penicillin-Streptomycin hinzu. Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Sterilfilter. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
- Übertragen Sie das Nährmedium mindestens 30 Minuten vor Gebrauch in einen Gewebekulturkolben mit belüfteter Kappe. Der Kolben mit dem Nährmedium wird in einen Inkubator mit einer CO2 -Konzentration von 5 % bei 37 °C gestellt.
>2. Herstellung von Verreibpipetten
HINWEIS: Verreibpipetten können für mehrere Experimente wiederverwendet werden. Spülen Sie die Pipetten vor jedem Gebrauch mit Ethanol, Wasser und L-15-Lösung und reinigen Sie sie nach jedem Gebrauch mit Wasser und Ethanol. Zwischen den Anwendungen sorgfältig aufbewahren.
- Um Verreibpipetten für die Zelldissoziation vorzubereiten, halten Sie eine Pasteurpipette aus Glas an die Flamme eines Bunsenbrenners. Sobald die Glasspitze zu schmelzen beginnt, dehnen Sie das Glas auf den gewünschten Spitzendurchmesser aus. Ziehe ein Ende der Pipette von der Flamme weg, um eine kleine Biegung zu erzeugen.
- Bringen Sie die gebogene Pipette in die Nähe eines Mikroskops. Mit einer Ritzplättchen das Glas auf den gewünschten Durchmesser einritzen und zerbrechen.
- Führen Sie die Spitze der Pipette über die Oberseite der Bunsenbrennerflamme. So werden die rauen Kanten in der Nähe der Spitze schnell poliert. Vergewissern Sie sich, dass die Spitze nicht von der Flamme versiegelt wird.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis vier oder fünf Pipetten unterschiedlicher Größe vorbereitet sind.
>3. Extraktion des vestibulären Ganglions und Plattierung vestibulärer Neuronen
- Vorbereitung für die Dissektion
- Bereiten Sie eine Enzymmischung aus L-15-Lösung mit 0,05 % Kollagenase und 0,25 % Trypsin vor. Geben Sie zum Beispiel 0,001 g Kollagenase und 0,005 g Trypsin zu 2 ml L-15-Lösung in ein Becherglas, fügen Sie einen kleinen Magnetrührer hinzu und rühren Sie, bis alles vollständig vermischt ist. Bei Raumtemperatur beiseite stellen.
- Bereiten Sie eine kommerziell erhältliche Guillotine vor, indem Sie Papiertücher zur Seite und unter die Guillotine legen, um die Exposition der Tischplatte und anderer Oberflächen gegenüber Blut und anderen biologischen Materialien zu minimieren.
- Lege eine große Edelstahlschere, eine große Pinzette und eine große Federschere aus. Halten Sie eine große Sprühflasche mit 70% Ethanol für die Kopfreinigung bereit.
- Füllen Sie ein 100-ml-Becherglas mit L-15-Lösung und legen Sie es auf Eis. Die L-15-Lösung mit Sauerstoff anreichern.
- Legen Sie die Federschere, die chirurgische Schere, die Pinzette, das Skalpell und die Transferpipette aus (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie eine 60 mm Petrischale (für die grobe Dissektion) und zwei 35 mm Petrischalen (für die Reinigung/Feindissektion der Ganglien) vor. Füllen Sie die 60-mm-Schale mit sauerstoffhaltiger L-15-Lösung mit einer 30-ml-Spritze mit einer 0,22-μm-Filterspitze.
- Euthanasie, Kopfreinigung und Hemisektion
- Wiegen Sie die Jungtiere, um die geeignete Dosierung der Fatal-Plus-Verdünnung für die intraperitoneale Verabreichung zu berechnen (~0,01 ml pro 10 g).
- Sobald eine tiefe Anästhesieebene erreicht ist, die durch eine mangelnde Reaktion auf das Zehenkneifen beurteilt wird, enthaupten Sie mit der Guillotine.
- Spülen Sie den Kopf gründlich mit 70% Ethanol und dann gründlich mit L-15-Lösung ab.
- Entferne die Haut vollständig vom Schädel. Halbieren Sie den Kopf mit einer großen Federschere, indem Sie am Eintrittspunkt des Rückenmarks zum Gehirn beginnen und zwei Schnitte machen, den ersten Schnitt durch die Oberseite des Schädels und den zweiten durch die Unterseite des Kiefers. Halbieren Sie den Kopf mit einer chirurgischen Schere.
- Legen Sie beide Hälften des Kopfhirns mit der Seite nach unten in eine 60 mm Petrischale, die mit L-15-Lösung gefüllt ist. Legen Sie das frische Gewebe, das gerade nicht präpariert wird, auf Eis.
- Extraktion des Ganglion vestibularis superior
- Schöpfen Sie das Gehirn mit einer geschlossenen chirurgischen Schere heraus. Durchtrennen und entfernen Sie den Hirnnerv, um das Gehirn vollständig vom Schädel zu lösen.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sollte die otische Kapsel (in Form der Zahl 8) am Hinterkopf sichtbar sein.
- Ziehen Sie mit einer Pinzette am Hinterkopf beginnend durchsichtiges membranöses Material ab.
- Schneide die Oberseite des Schädels mit einer chirurgischen Schere heraus. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe am Hinterkopf und am Hals, um den Präparierbereich und die Kapsel sauberer und leichter zugänglich zu machen.
Anmerkung: Vermeiden Sie es, das Gericht zu trüb zu machen, indem Sie überschüssiges Gewebe während des gesamten Eingriffs entsorgen.
- Übertragen Sie das Gewebe in eine zweite Petrischale mit frischer L-15-Lösung. Lokalisieren Sie die Kapsel oticus und den Nervus auditorialis, den Nervus vestibularis superior und den Nervus vestibularis inferior. Den Hörnerv abtrennen und mit einer kleinen Federschere die Ganglien superior und inferior trennen.
Anmerkung: Obwohl die Somata des Nervus vestibularis sowohl in den unteren (dünneren) als auch in den oberen (dickeren) Ganglien zu finden sind, haben Zellen, die aus dem Ganglion superior extrahiert werden, ein besseres Überleben.
- Rasieren Sie mit einem Skalpell den knöchernen Kamm vorsichtig ab, um den knöchernen Bereich zu schwächen, unter dem der Nerv in die knöcherne Kapsel eintaucht. Entfernen Sie vorsichtig Ablagerungen mit einer feinen Pinzette und legen Sie den gesamten geschwollenen Teil des Ganglion frei.
- Schneide und trenne mit der feinen Federschere das Ganglion vom peripheren Nervenast, der in Richtung Utricula abtaucht.
- Entfernen Sie das Ganglion superior mit einer feinen Pinzette und achten Sie darauf, dass Sie nicht zu nahe am Gangliengewebe einklemmen. In eine 35 mm Petrischale mit frischer L-15-Lösung geben.
- Bevor Sie fortfahren, heizen Sie die Enzymlösung vor: Gießen Sie die Enzymmischung in eine 35 mm Petrischale und stellen Sie sie für 10-15 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator.
- Reinigen Sie das Ganglion mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Federschere, indem Sie Knochen (der weiß und kristallisiert erscheint), überschüssiges Gewebe, Nervenfasern und alle anderen überflüssigen Strukturen entfernen. Achten Sie darauf, die Entfernung von Gangliengewebe zu minimieren.
- Dissoziation und Plattierung des Gewebes
- Übertragen Sie die gereinigten Ganglien in die vorgewärmte Enzymlösung und legen Sie sie für 10 bis 40 Minuten zurück in den Inkubator. Die Enzymbehandlung ist abgeschlossen, sobald das Gewebe zu zerbrechen beginnt, aber in einem Stück verbleibt. Eine Überbehandlung des Gewebes mit Enzymen führt zu einer vollständigen Auflösung der Ganglien vor der Verreibung.
HINWEIS: Die Zeit, die das Gewebe einer enzymatischen Behandlung unterzogen wird, hängt vom Alter des Tieres ab. Zum Beispiel werden Ganglien von P9-Ratten 25 Minuten lang mit Enzym behandelt, und Ganglien von P15-Ratten werden 35 Minuten lang mit Enzym behandelt.
- Die Ganglien mit frischer L-15-Lösung in die 35 mm Petrischale geben und 2-3 min inkubieren.
- Übertragen Sie die Ganglien in eine weitere 35-mm-Petrischale, die mit gefiltertem Nährmedium gefüllt ist.
- Pipettieren Sie mit einer 200-μl-Mikropipette einen ~150-μl-Tropfen gefiltertes Kulturmedium auf eine beschichtete Glasbodenschale. Fügen Sie nicht zu viel Lösung hinzu, da es wichtig ist, die Oberflächenspannung aufrechtzuerhalten, um eine Lösungsblase zu bilden, die über dem Glasdeckglas verbleibt.
- Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Ganglien (eins bis vier) auf das Deckglas.
- Ziehen Sie eine kleine Menge Nährmedium aus der Kulturschale und spülen Sie die Verreibpipette mit Medium ab, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Seiten der Glaspipette kleben bleibt. Zerreiben Sie, indem Sie das Gewebe vorsichtig und wiederholt durch die Pipette führen, bis die Ganglien ausreichend dissoziiert sind.
Anmerkung: Überanstrengen Sie das Gewebe nicht, um Einzelzellsuspensionen zu versuchen, oder lassen Sie die Zellen mit übermäßigem Überdruck auf den Boden der Schale krachen. Vermeiden Sie auch die Bildung von Luftblasen, da dies das Überleben der Zellen verringert. Sanfte Verreibung ist der Schlüssel zu einem erfolgreichen Überleben der Zellen.
- Lassen Sie die Zellen 5 Minuten ruhen. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, ob sich die Zellen auf dem Deckglas abgesetzt haben.
- Stellen Sie eine Kulturschale vorsichtig für 12-24 Stunden in einen 37 °C heißen Inkubator. Achten Sie auch hier darauf, dass die Lösungsblase intakt bleibt.
Anmerkung: Wenn Sie länger als 24 Stunden kultivieren, sollten Sie die Nährmedien täglich auffrischen. Dies kann ein möglicher Pausenpunkt sein.
