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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Dissoziation des Gewebes
HINWEIS: Alle folgenden Verfahren werden in einer sterilen Gewebekultur, die als Biosicherheitswerkbank ausgewiesen ist, unter Verwendung aseptischer Technik und steriler Materialien durchgeführt.
- Geben Sie 1 ml 0,05 % Trypsin mit 0,53 mM EDTA in jedes konische 15-ml-Röhrchen mit 9 ml DMEM und Gewebe, um mit der Gewebelyse zu beginnen.
Anmerkung: DMEM enthält eine hohe Menge an Calciumchlorid, das als Inhibitor von Trypsin wirken kann. Wenn die Dissoziation nach den beschriebenen Schritten nicht vollständig ist, kann Hanks' Balanced Salt Solution ohne Calcium oder Magnesium verwendet werden. Nach der Trypsinisierung kann das Enzym durch Zugabe eines Trypsin-Inhibitors neutralisiert werden, obwohl Kalzium wieder in die Lösung gegeben werden sollte, da es ein Cofaktor für DNase I ist, der in den nachfolgenden Schritten verwendet wird.
- Zerreiben Sie mit einer 10-ml-Pipette ca. 20x.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in leere konische 50-ml-Röhrchen.
- Die Lösung wird bei 37 °C, 5 % CO2 15 min inkubiert, wobei die Lysate nach 8 min vorsichtig gerührt werden.
- Geben Sie 5 ml MGM und 200 μl (5 mg/ml) DNase I in jedes Röhrchen, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erreichen.
- Trituieren Sie jedes Lysat mit einer 10-ml-Pipette 10x.
- Lassen Sie die Zellsuspensionen 3 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, damit sich nicht dissoziiertes Gewebe am Boden der Röhrchen absetzen kann.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in neue konische 50-ml-Röhrchen, wobei das nicht dissoziierte Gewebe zurückbleibt.
Anmerkung: Die oben beschriebenen Lyse- und Verreibungsschritte begrenzen die Menge an nicht dissoziiertem Gewebe erheblich.
- Die Röhrchen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C ohne Bremse zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die restlichen Zellpellets in 5 mL MGM.
- Zerreiben Sie das Pellet mit einer 5-ml-Pipette 20x.
- Die 5-ml-Zellsuspensionen werden auf beschichtete T25-Kolben aufgebracht.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium zunächst nach 24 h, um Zelltrümmer zu entfernen.
Anmerkung: Einige Protokolle empfehlen einen ersten Medienwechsel nach 72 h. Möglicherweise ist eine Optimierung dieses Schritts erforderlich.
- Führen Sie alle 48-72 Stunden einen 100%igen Medienwechsel mit MGM durch, bis die Zellen zu 80 % konfluent sind (ca. 5-7 Tage).
HINWEIS: Alle Medien müssen auf 37 °C erwärmt werden, bevor das Medium gewechselt wird.
>2. Isolierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
Bei der Beschichtung von OPCs nach der Erstisolierung müssen sie auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche (sterile Platte oder Deckglas) plattiert werden. Bereiten Sie diese Materialien vor, bevor Sie diesen Abschnitt abschließen.
- Nach 15-stündigem Schütteln wird der Überstand aus den Kolben genommen und auf eine sterile 100-mm-Petrischale gelegt
.
- Den Überstand bei 37 °C, 5 % CO2 30 min inkubieren und nach 15 min schwenken, um die restlichen Mikroglia zu entfernen, da diese sehr schnell an der Schale haften. Für diesen Schritt können Petrischalen verwendet werden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurden.
- Entfernen Sie den nicht adhärenten Zellüberstand, zählen Sie ihn und legen Sie ihn auf eine Poly-D-Lysin-beschichtete Oberfläche. Typischerweise werden 7.500-10.000 OPCs plattiert/cm2.
- Bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 1 h (bis zu 6 h) inkubieren, dann 95 % des Mediums vorsichtig ansaugen und langsam warmes OPC-Medium hinzufügen, wobei das Medium gegen die Wand der Vertiefung pipettiert wird, um die Störung durch OPCs zu minimieren. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen einsatzbereit sind.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass jeweils nur ein Bohrloch gewechselt wird. OPCs sind empfindlich und besonders unverträglich gegenüber trockenen Bedingungen. Die Zugabe von PDGF-AA in OPC-Medien soll die OPC-Reifung zu Oligodendrozyten verzögern. Dieser Faktor kann von Nährmedien ausgeschlossen werden, wenn der experimentelle Schwerpunkt auf reifen Oligodendrozyten liegt.
Tabelle 1: Puffer- und Medienrezepte.
Gemischte Glia Medien (MGM)
| 88 mL | 1X DMEM (hoher Glukosegehalt, mit L-Glutamin, mit Na-Pyruvat) |
| 10 mL | Hitzeinaktiviertes FBS |
| 1,0 mL | L-Glutamin (100-fach) |
| 1,0 mL | Antibiotikum/Antimykotikum |
OPC Medien (50mL)
| 49 mL | Neurobasale Medien |
| 1,0 mL | B27-Zuschlag (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| HINWEIS: PDGF-AA wird vor jedem Medienwechsel neu hinzugefügt. |