Eine Technik zur Erzeugung von Gehirn-Organoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Boisvert, E. M., et al. Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Gehirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen. J. Vis. Exp (2020).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung von zerebralen Organoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs). Die adhärente Kultur von hES-Kolonien wird mit Enzymen behandelt, um sie abzulösen und in Cluster zu zerlegen. Diese Cluster bilden dreidimensionale Kugeln in Suspension, die dann dazu gebracht werden, sich zu Organoiden zu differenzieren, die die Hirnrinde mit Schichten von Neuronen und Gliazellen nachahmen.

Protokoll

>1. Erhaltung von Stammzellen

1. Halten Sie H9 hESCs auf einer Schicht aus wachstumsfaktorreduzierter Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle, im Folgenden einfach als Matrix bezeichnet) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Um eine 6-Well-Platte oder eine 10-cm-Schale zu beschichten, kombinieren Sie 100 μl Matrix mit 5,9 mL eiskaltem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12-Medium. Wickeln Sie die Platten in Paraffinfolie ein und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie sie am nächsten Tag zur Passage der Zellen, nachdem die überschüssige Matrix/das überschüssige Medium abgesaugt wurde.
2. Kultivieren Sie die Zellen Woche für Woche mit einem Aufteilungsverhältnis von etwa 1:12 alle 7 Tage. Halten Sie die Zellen mit mTESR-1-Medien in einem 37 °C heißen Inkubator mit niedrigem Sauerstoffgehalt (5 % O₂, 5 % CO₂). Aktualisieren Sie die Medien täglich. Aussortieren Sie differenzierende Zellen aus der Kultur zwischen den Durchgängen mit Glaswerkzeugen.
3. H9-Zellen sollten vier bis sechs Tage vor der Verwendung zur Herstellung von Organoiden passaget werden. Die Zellen sollten in einem Verhältnis von etwa 1:8 von Zellclustern durchlaufen werden. Um dies zu tun, beginnen Sie damit, die Zellen mit dem modifizierten Medium Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12) von Dulbecco zu spülen und die Zellen mit einer neutralen Protease zu dissoziieren (z. B. Dispase, im Folgenden einfach als Protease bezeichnet), mit DMEM/F-12 zu spülen und als 30-60 Zellcluster auf 4 Platten (6-Well oder 10 cm) bei ~20% Konfluenz zu plattieren. Stellen Sie sie zwei Tage vor der Ernte in einen regulären Brutschrank (21 % O₂, 5 % CO₂) um. Die Platten sollten ~80% Konfluenz erreichen, wenn sie mit der Organoidbildung beginnen.

>2. Dissoziation der hESCs für die Organoidkultur

1. Aliquotieren Sie die Protease-Stammlösung (5 U/ml).
   Anmerkung: In der Regel frieren wir 1 ml-Aliquote bei -20 °C ein, um sie über mehrere Monate zu verwenden.
2. Verdünnen Sie die Protease-Stammlösung auf die Arbeitskonzentration, indem Sie 1 ml der Stammlösung plus 5 ml DMEM/F12 für jede 6-Well- oder 10-cm-Platte mit hES-Zellen hinzufügen.
3. Aspirieren und entfernen Sie das Zellkulturmedium und bedecken Sie dann die hES-Zellen mit der Proteaselösung. Legen Sie die Platten für 10-15 Minuten in den Inkubator oder bis sich die Ränder der Völker abrunden und beginnen, sich von der Matrix zu lösen.
4. Kippen Sie die Platte, aspirieren Sie die Proteaselösung und waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit DMEM/F12. Verwenden Sie 2 ml/Well für jede Wäsche, wenn Sie eine 6-Well-Platte verwenden, und 6 mL, wenn Sie eine 10-cm-Platte verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien an der Matrix befestigt bleiben, wenn Sie diesen Schritt ausführen.
5. Geben Sie etwa 1,5 ml frisches mTESR-Medium in jede Vertiefung (oder 5 mL für eine 10-cm-Platte) und spülen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren von der Platte.
6. Aspirieren und dispensieren Sie mit einer 10-ml-Pipette vorsichtig hES-Zellen in der Platte, bis sie etwa 1/30 ihrer ursprünglichen Größe erreicht haben. Koloniecluster sollten nach Abschluss dieser Schritte ~250-350 μm großen Quadraten ähneln.

>3. Erzeugung von Organoiden

1. Die Zellen werden in einen einzigen T75-Kolben mit extrem geringer Bindung überführt, der 30 ml mTESR-Medium ohne basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) enthält.
2. Kippen Sie am nächsten Tag die Flasche(n) so, dass sich die lebenden Zellen in der Ecke ansammeln (dies kann am ersten Tag 5-10 Minuten dauern, wird aber schneller, wenn die Cluster größer werden).
   Anmerkung: Wenn bei diesem Schritt oder in einem der nachfolgenden Schritte eine große Anzahl von Zellen am Boden des Kolbens haftet, so werden die Zellen in einen neuen Kolben übertragen. Es ist normal, in den ersten zwei Tagen eine hohe Population abgestorbener Zellen zu haben. Achten Sie beim Wechseln des Mediums darauf, so viel Zelltrümmer wie möglich zu entfernen.
3. Sobald sich die Zellen abgesetzt haben, aspirieren Sie das Medium und die abgestorbenen Zellen, so dass etwa 10 ml Medium übrig bleiben, das die lebenden Zellen enthält.
4. Fügen Sie ~20 ml Medium mit niedrigem bFGF-Gehalt hinzu (DMEM/F12, ergänzt mit 1x N2, 1x B27, 1x L-Glutamin, 1x nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 0,05 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM Monothioglycerin (MTG), ergänzt mit 30 ng/ml bFGF).
5. Überprüfen Sie die Zellen an Tag 2. Wenn die meisten Zellen gesund und hell aussehen, muss man nichts tun. Wenn jedoch mehr als ein Drittel der Zellen dunkel erscheint, ersetzen Sie das Medium (unter Verwendung der gleichen Kipptechnik wie in Schritt 3.2) durch ~20 mL Medium mit niedrigem bFGF-Gehalt, das mit 20 ng/mL bFGF ergänzt wird.
6. An Tag 3 wird die Hälfte des Mediums (unter Verwendung der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 mL Medium mit niedrigem bFGF-Gehalt ersetzt, das mit 10 ng/mL bFGF ergänzt wird.
7. Ersetzen Sie an Tag 5 die Hälfte des Mediums (unter Verwendung der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 mL neuronales Induktionsmedium (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL Heparin).
   Anmerkung: Wenn es große Ansammlungen von Zellen oder Organoiden gibt, die viel größer sind als die anderen, sollten sie aus der Kultur entfernt werden. Die Größe wird anhand des Aussehens unter dem Mikroskop geschätzt; Zum Beispiel mit einem Okular mit Absehen. Die Mehrzahl der Organoide ist ähnlich groß (etwa 100 ± 20 μm). Wir entfernten Organoide, die etwa 2x kleiner oder größer als die anderen waren.
8. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums (~15 ml) (mit der Kipptechnik) durch NIM.
9. Nach 3 Wochen in Kultur geben Sie 100x Penicillin/Streptomycin in das Medium (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL Heparin), falls gewünscht, in einer Endkonzentration von 1x. Aktualisieren Sie die Medien jeden zweiten Tag.
   Anmerkung: Auf diese Weise haben wir die Organoide bis zu 6 Monate in Kultur aufbewahrt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
B27 Beilage	Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. A9647
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Tel.: 11330-032
DPBS (Englisch)	Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	10010023
Wachstumsfaktor reduziertes Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, Vereinigte Staaten von Amerika	356231
H9 hES-Zellen	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 9041-08-01
L-Glutamin	Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 25030-081
Monothioglycerin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	M6145
mTESR Medien	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	Artikel-Nr.: 85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, Kalifornien, USA	Nr. 400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	T8787-100ML
T75-Kolben mit extrem niedrigem Aufsatz	Corning, Corning, NY, Vereinigte Staaten von Amerika	3814

kg