1. Dissektion des ventralen Mittelhirns und des Rückenmarks
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte mit Ausnahme der Schritte 1.1.1-1.1.3 und 1.1.5-1.1.6 unter einem Fluoreszenzdissektions-Stereomikroskop durch. Die Gesamtdissektionszeit pro Experiment beträgt in der Regel 3-5 Stunden, abhängig von der Beherrschung der Dissektionstechnik und der Anzahl der für jedes Experiment erforderlichen Motoneuronen.
- Dissektion des ventralen Mittelhirns
- Euthanasieren Sie eine trächtige Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung durch Kohlendioxidgas und Gebärmutterhalsluxation.
- Besprühen Sie den Bauch gründlich mit Ethanol und entfernen Sie die Gebärmutter mit einer sterilen Mikro-Präparierschere und einer Daumenverbandszange. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und geben Sie sie dann auf die mit vorgekühltem sterilem PBS gefüllte Präparierplatte.
- Entnehmen Sie die IslMN:GFP (Islet Motor Neuron: grün fluoreszierendes Protein) positiven Embryonen vorsichtig aus der Gebärmutter mit einer sterilen Mikro-Präparierschere, einer Daumenverbandszange und einer Dumont #5 Pinzette in eiskalter, steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter dem hellen Licht des Mikroskops. Übertragen Sie jeden Embryo mit einem sterilen Moria-Mini-perforierten Löffel in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit vorgekühltem Hibernate-E-Medium mit niedriger Fluoreszenz gefüllt ist, das mit 1x B27 ergänzt wird. Bewahren Sie die 24-Well-Platte auf Eis auf.
- Übertragen Sie einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte und bedecken Sie sie vollständig mit eiskalter, steriler Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Stellen Sie sicher, dass die Dissektionsschritte unter Fluorescein-Isothiocyanat-Beleuchtung (FITC) des Mikroskops durchgeführt werden. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Schwanz und das Gesicht des Embryos, ohne das Mittelhirn zu beschädigen (Abbildung 1Ba). Platzieren Sie den Embryo in Bauchlage, mit den darunter gespreizten Gliedmaßen und dem Schwanz, der zur Vorderseite des Mikroskops zeigt, in Richtung des Dissektors (gekennzeichnet durch ein Sternchen, Abbildung 1Bb).
- Schlitzen Sie mit einer Pinzette das Dach des vierten Ventrikels auf, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Nutze diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Präparieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryos rostral zur Rinde und lateral zur Bodenplatte und motorischen Säule (Abbildung 1Ca,b). Öffnen Sie das präparierte Gewebe in einer Open-Book-Manier, um die Kerne des GFP-positiven okulomotorischen Neurons (Hirnnerv 3 [CN3]) und des Trochlea-Neurons (Hirnnerv 4 [CN4]) freizulegen
HINWEIS: Ein kleines Stück Gewebe aus dem ventralen Mittelhirn, das Mesenchym, CN3 und CN4 enthält, wird nun freigelegt.
- Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie das Hirnhautgewebe mit einer Pinzette und einem Mikropräpariermesser. Präparieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne mit einer Pinzette und einem Mikropräpariermesser von der Bodenplatte und anderen GFP-negativen umgebenden Geweben (Abbildung 1D). Maximieren Sie die Anzahl der GFP-positiven Motoneuronen im herausgeschnittenen Gewebe, aber vermeiden Sie es, sie zu berühren oder zu beschädigen.
- Wenn eine Ansammlung separater CN3- und CN4-Kerne gewünscht wird, schneiden Sie entlang der Mittellinie dieser beiden Kerne (gelbe gestrichelte Linie in Abbildung 1D). Entnehmen Sie mit einer P1000-Pipette das präparierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS und legen Sie es in ein markiertes 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Dissektionsmedium gefüllt ist. Bis zur Dissoziation auf Eis lagern.
- Fahren Sie mit dem Poolen des ventralen Mittelhirns von weiteren Embryonen im selben Röhrchen fort, bis die Gesamtzahl den experimentellen Anforderungen entspricht (siehe Schritt 4 für ideale Zellzahlen).
HINWEIS: Eine gepoolte Sammlung von mindestens 10 ventralen Mittelhirnen, die etwa 1 x 104 CN3/CN4-Motoneuronen ergeben, wird empfohlen, da das Gewebe während der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt ist.
- Ventrale Rückenmarksdissektion
- Halten Sie den Embryo liegend mit dem Kopf zur Vorderseite des Mikroskops, in Richtung des Dissektors. Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette fest und führen Sie die Spitze der anderen Pinzette in den ungeöffneten kaudalen Teil des vierten Ventrikels ein.
- Der Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks wird dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos geöffnet. Eröffnen Sie durch Schneiden des dorsalen Gewebes, beginnend mit dem vierten Ventrikel und mit der Pinzette als Schere in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks (Abbildung 1Ca, b). Achten Sie darauf, das ventrale Rückenmark während dieses Eingriffs nicht zu berühren oder zu beschädigen.
- Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette fest und kneifen Sie mit der anderen Pinzette den Lappen des Rückengewebes auf jeder Seite ab (Abbildung 1Ea,b).
HINWEIS: Herausgeschnittenes Rückengewebe enthält die dorsale Haut, das Mesenchym, die Spinalwurzelganglien (DRGs), das dorsale Hinterhirn und das Rückenmark. Entfernen Sie so viel wie möglich von diesem Gewebe, ohne die Kerne des spinalen Motoneurons (SMN) zu beschädigen, da sie haftend sind und SMNs während der Filterung einfangen oder Verstopfungen bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) verursachen können.
- Entfernen Sie das ventrale Rückenmark mit dem Mikrodissektionsmesser, um direkt unterhalb der GFP-positiven SMN zu stechen. Heben Sie das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten an (Abbildung 1Fa,b). Schneiden Sie das schwimmende ventrale Rückenmark quer direkt über C1, wo das erste GFP-positive Vorderhorn hervorsteht (Abbildung 1G). Schneiden Sie auch quer an der oberen Grenze der unteren Extremität (Abbildung 1G). Entfernen Sie nach diesem Eingriff den zervikalen (C1)-lumbalen (L2-L3) Teil des ventralen Rückenmarks.
- Legen Sie das ventrale Rückenmark mit der dorsalen Seite nach oben und halten Sie es fest, indem Sie es mit einer Pinzette zwischen die GFP-positiven SMN-Säulen drücken. Entfernen Sie das verbleibende anhaftende Mesenchym, die DRGs und das dorsale Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser abschneiden (Abbildung 1H). Achten Sie darauf, GFP-positive Motoneuronen zu maximieren, ohne sie zu beschädigen.
- Entnehmen Sie mit einer P1000-Pipette das präparierte ventrale Rückenmarksgewebe mit minimalem HBSS und legen Sie es in das SMN-markierte 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Dissektionsmedium gefüllt ist. Bis zur Dissoziation auf Eis lagern. Fahren Sie mit dem Poolen des ventralen Rückenmarks von weiteren Embryonen in derselben Röhre fort, bis die Gesamtzahl den experimentellen Anforderungen entspricht.
Anmerkung: Es wird empfohlen, mindestens drei ventrale Rückenmark zu entnehmen, die etwa 2,1 x 104 SMN ergeben, da das Gewebe während der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt ist.
- Sammeln Sie faziale Motoneuronen und Extremitäten der IslMN:GFP-Mausembryonen als GFP-positive bzw. GFP-negative Kontrollen für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Die Extremitäten sind GFP-negativ, da sich die GFP-positiven Axone der SMNs in diesem Embryonalalter noch nicht in die Extremitäten ausgestreckt haben.
2. Dissoziation des Gewebes
HINWEIS: Die Gesamtdissoziationszeit beträgt typischerweise 1,5 h pro Experiment.
- Papain und Albumin-Ovomucoid-Hemmerlösung aliquotiert auf 37 °C 30 min vor der Dissoziation
.
- Schleudern Sie mikropräpariertes Gewebe kurz bei niedriger Geschwindigkeit herunter.
- Entfernen Sie mit einer P100-Pipette vorsichtig so viel Hibernate E wie möglich, ohne das Gewebe zu aspirieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nach diesem Schritt alle Reste von Hibernate E zu entfernen, um eine Verringerung der Wirksamkeit der Papain-Dissoziation im nächsten Schritt zu vermeiden.
- Geben Sie das entsprechende Volumen Papainlösung (Tabelle 1) in jedes der 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die die mikropräparierten Gewebeproben enthalten.
HINWEIS: Das für die Dissoziation geeignete Volumen an Papain wurde bestimmt, um die effektive Dissoziation zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren.
- 8x vorsichtig mit einer P200-Pipette zerkleinern. Führen Sie alle Verreibungsschritte schonend durch, um die Lebensfähigkeit der Motoneuronen zu erhalten.
- Die Röhrchen mit dem Gewebe werden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und alle 10 Minuten 10x mit den Fingern gerührt. Jede Suspension wird nach der Inkubation 8x mit einer P200-Pipette vorsichtig zerrieben. Schleudern Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
- Um die Wirksamkeit der Ovomucoid-Hemmung im nächsten Schritt sicherzustellen, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu verwerfen, ohne das Gewebe zu aspirieren.
- Resuspendieren Sie die Pellets in der entsprechenden Menge der Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (Tabelle 1), indem Sie 8x mit einer P200-Pipette vorsichtig verreiben.
- Warten Sie 2 Minuten, bis sich alle verbleibenden Stücke undissoziierten Gewebes am Boden des Röhrchens absetzen können.
- Sammeln Sie mit einer P200-Pipette so viel Überstand wie möglich, ohne undissoziiertes Gewebe zu aspirieren. Den Überstand in frische 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Wenn einige Gewebestücke nach Schritt 2.10 undissoziiert bleiben, wiederholen Sie die Schritte 2.8 bis 2.10 für die undissoziierten Gewebe, die in den ursprünglichen 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verbleiben, um die endgültige Ausbeute an dissoziierten Zellen zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der zuvor dissoziierten Zellen zu minimieren, die im Überstand von Schritt 2.10 enthalten sind.
- Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g herunter. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000-Pipette.
- Resuspendieren Sie das Pellet in das entsprechende Volumen des Dissektionsmediums (Tabelle 1), indem Sie 8x mit einer P1000-Pipette pipettieren. Das geeignete Volumen der endgültigen Suspension wurde so bestimmt, dass die Zelldichte 107 Zellen/ml nicht überschreitet, was den Strom des Durchflusszytometriegeräts blockieren kann, aber auch damit die Zellen nicht übermäßig verdünnt werden, was zu einer verlangsamten Sortiergeschwindigkeit führt.
- Filtern Sie die Suspensionen durch 70-μm-Zellsiebe, um große Klumpen oder unverdautes Gewebe zu entfernen. Übertragen Sie die Suspensionen in 5-ml-Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis.
3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem FACS-Sortierer optimiert, der mit einem 15 mW 405 nm violetten Laser, einem 100 mw 488 nm blauen Laser, einem 75 mw 594 nm orangefarbenen Laser und einem 40 mw 640 nm roten Laser ausgestattet ist. Die Zellen wurden als Mantelflüssigkeit in sterilem PBS unter aseptischen Bedingungen durch eine 100 μm Düse sortiert. Um die Zellbelastung zu minimieren, wurde die Flussrate auf einen Probendruck von 1−3 eingestellt, so dass maximal 1.000−4.000 Ereignisse pro Sekunde erfasst wurden. Die gesamte FACS-Zeit beträgt typischerweise 1-2 h pro Experiment.
- Richten Sie Spannungen für Durchlass- und Seitenstreuung ein, damit die Zellpopulation richtig visualisiert werden kann. Das Einrichten geeigneter Spannungen für die Zellsortierung ist komplex und erfordert einen erfahrenen FACS-Bediener.
- Um verschiedene Zellpopulationen zu unterscheiden, plotten Sie Zellen basierend auf der Größe, die durch die Forward Scatter Area (FSC-A) bestimmt wird, und der internen Komplexität, die durch die Side Scatter Area (SSC-A) bestimmt wird. Zeichnen Sie ein Tor um die lebenden Zellen, wie in Abbildung 2Aa und Abbildung Ba gezeigt, um Ablagerungen und tote Zellen auszuschließen. Gruppieren Sie die Zellen innerhalb des abgegrenzten Bereichs als Population 1 (P1).
- Um Zellklumpen und Dubletten auszuschließen, zeichnen Sie als nächstes P1-Zellen basierend auf der Seitenstreubreite (SSC-W) im Vergleich zu SSC-A. Gate der Population einzelner Zellen als Population 2 (P2) (Abbildung 2Ab und Abbildung Bb).
- Plotten Sie P2-Zellen basierend auf der Vorwärtsstreubreite (FSC-W) im Vergleich zur FSC-A und gatten Sie die Population einzelner Zellen als Population 3 (P3) (Abbildung 2Ac und Abbildung Bc).
Anmerkung: Die Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Gates in 3.3 und 3.4 schließt Zellklumpen und Dubletten (hoher FSC-W und hoher FSC-A) aus.
- Gate P3-Zellen basierend auf GFP im Vergleich zu Allophycocyanin (APC). Der APC-Kanal erkennt Autofluoreszenz. Das Gating auf diesem Kanal vermeidet das Einfangen von autofluoreszierenden Zellen. Verwenden Sie GFP-negative Zellen, um die Spannung für FITC/GFP-Leuchtstoffkanäle einzustellen. Idealerweise positionieren Sie die Gates für diese Zellpopulationen um 102. Wählen Sie die Gate-Schwellenwerte für die GFP-positive Population 4 (P4) individuell für jeden Typ von Motoneuron aus (Abbildung 2Ad und Abbildung Bd).
HINWEIS: Stellen Sie das GFP-Gate für SMNs viel höher ein als für CN3s/CN4s, um eine Reinkultur zu erhalten (Abbildung 2Ad und Abbildung Bd). Ein niedrigeres GFP-Gate für SMN-Kulturen führt zu einer Kontamination der Kulturen durch Gliazellen und nicht-motorische Neuronen. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass es in einigen Gliazellen und nicht-motorischen Neuronen aufgrund eines undichten Promotors eine geringe GFP-Expression gibt. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen im Vergleich zur Gesamtzelle beträgt typischerweise 0,5-1,5 % für CN3s/CN4-Zellen und 1,5-2,5 % für SMNs. Wenn die Dissektion erfolgreich war, können diese Zahlen als Benchmark verwendet werden, um die geeignete Position für das GFP-positive Gate zu bestimmen (Abbildung 2Ae und Abbildung Be).
- Führen Sie FACS gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Sammeln Sie P4-Zellen in frische 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die mit 500 μl Motoneuronen-Kulturmedium gefüllt sind. Bis zum Anrichten auf Eis lagern.
Anmerkung: Obwohl die Zellen direkt in die Wells einsortiert werden können, ergibt sich dadurch eine ungerade Anzahl von Zellen pro Well. Sortieren Sie die Zellen in 1,75-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und plattieren Sie sie dann manuell, um eine gleichmäßigere Verteilung der Beschichtung zu erreichen.
4. Kultur von gereinigten primären Motoneuronen
- Verdünnen Sie FACS-isolierte CN3/CN4- und SMN-Suspensionen mit auf 37 ΰC vorgewärmtem Motoneuronen-Kulturmedium auf Dichten von 5 x 103 bzw. 1 x 104 Zellen/ml.
Anmerkung: Ein E11.5-Embryo ergibt etwa 1 x 103 CN3/CN4 und 7 x 103 SMN. Diese Ausbeuten hängen jedoch stark von der Reinheit des präparierten Gewebes, der Gründlichkeit der Zelldissoziation und der angemessenen Schwellenwertierung der GFP-Gates während der FACS ab.
- Übertragen Sie 96 Well-Platten, die mit Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin vorbeschichtet sind, aus dem 37 °C-Gewebekultur-Inkubator in die Laminar-Flow-Haube und saugen Sie Laminin aus jedem Well an. Platten und Deckgläser sofort ohne Waschen verwenden.
- Geben Sie 200 μl verdünnte CN3/CN4- und SMN-Suspensionen in die Vertiefung der PDL/Laminin-beschichteten 96-Well-Platten. Die endgültige Zelldichte sollte 1 x 103 bzw. 2 x 103 Zellen/Well für CN3/CN4 bzw. SMN betragen.
Anmerkung: Die anfängliche Plattierungsdichte von SMNs in 96-Well-Platten (2 x 10,3 Zellen/Well) ist doppelt so hoch wie die von CN3s/CN4s (1 x 10,3 Zellen/Well), um eine ähnliche endgültige Anzahl und Dichte der Motoneuronen nach 2 und 9 Tagen in vitro (DIV) (4-6 x 10,2 und 2-4 x 10,2 Zellen pro Well) zu erhalten, bzw.
- Kultivieren Sie Neuronen in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator.
- Füttern Sie die Neuronen alle 5 Tage, indem Sie die Hälfte des alten Mediums (100 μl) entfernen und durch das gleiche Volumen frisches Motoneuronen-Kulturmedium ersetzen. Stellen Sie sicher, dass neuronale Prozesse auf 1 DIV sichtbar werden und um 14 DIV dicker und länger werden (Abbildung 3). Neuronale Zellkörper vergrößern sich und neigen dazu, sich in Langzeitkulturen, insbesondere bei SMNs, zu aggregieren (Abbildung 3).
HINWEIS: Führen Sie alle Wechsel des Mediums und der Lösung durch, indem Sie die Hälfte des ursprünglichen Volumens des Mediums belassen, um ein Ablösen der kultivierten Zellen zu vermeiden. Dazu gehören Fixierungs- und Immunzytochemie (ICC)-Schritte. Wenn alle Medien entfernt werden, egal wie schonend, lösen sich die meisten Zellen ab und werden weggespült.
