Umgang mit neuronalen Stammzellkulturen in einer Zellproduktionsanlage

Zusammenfassung

Quelle: Stover, A. E., et al,. Kultivierung menschlicher pluripotenter und neuraler Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für die Grundlagen- und präklinische Forschung. J. Vis. Exp. (2016).

Das Video beschreibt das Verfahren zur Aufrechterhaltung einer kontrollierten Umgebung in einer Zellkultur-Workstation für das Wachstum und die Pflege von neuronalen Stammzellen. Diese Verfahren umfassen das Festlegen von Kammerbedingungen, Reinigungsprotokolle und die Vorbereitung des Mediums, um maximale Sterilität und Reproduzierbarkeit zu erhalten und die traditionellen Methoden zu ersetzen.

Protokoll

>1. Ersteinrichtung

1. Einstellen von Gas- und Temperaturkonzentrationen
   1. Klicken Sie mit der Software auf die Registerkarte "Gast" in der oberen linken Ecke der grafischen Oberfläche. Melden Sie sich mit einem bestimmten Benutzernamen und Passwort am System an. Stellen Sie sicher, dass jeder Benutzer seinen Benutzernamen und sein Passwort hat.
   2. Klicken Sie auf ein Modul, um es anzupassen (Abbildung 1). Klicken Sie in dem neuen Fenster mit den aktuellen Einstellungen auf den vorhandenen O₂ Sollwert unter "Sollwert" und geben Sie die gewünschte O₂ -Konzentration dieses Moduls ein. Geben Sie 5 % O₂ ein, wenn in diesem Modul pluripotente Stammzellen gezüchtet oder manipuliert werden, und 9 % O₂, wenn neurale Stammzellen gezüchtet oder manipuliert werden. Klicken Sie auf das grüne Häkchen, um den Sollwert zu bestätigen.
      Anmerkung: Zwei Module sind nicht gasverstellbar: die Laminarhaube und die Mikroskopkammer. Die Gaskonzentrationen in der Laminar-Flow-Haube sind atmosphärisch, während die Konzentrationen in der Prozesskammer die Konzentrationen in der Mikroskopkammer passiv aufrechterhalten.
   3. Wiederholen Sie diesen Schritt für CO₂. Geben Sie einen Sollwert von 5 % CO₂ für alle Module ein, mit Ausnahme der Pufferkammern, die nur für O₂ einstellbar sind.
   4. Überwachen Sie die aktuellen Gaskonzentrationen mit der Bezeichnung "Prozesswerte", um sicherzustellen, dass sie die neuen Sollwerte erreichen.
   5. Stellen Sie die Gassollwerte aller Module auf die entsprechenden Werte ein. Passen Sie die CO_{2 -} und O₂ -Werte der Kammern an, die einander ausgesetzt sind. Stellen Sie beispielsweise die Prozesskammer auf 5 % O₂ ein, bevor Sie einen Inkubator öffnen, der Zellen mit 5 % O₂ züchtet. Wechseln Sie außerdem in jeder Pufferkammer, die während dieser Zeit zum Hinzufügen von Gegenständen zur Prozesskammer verwendet wird, auf 5 % O₂.
   6. Stellen Sie die Temperatur der Prozesskammer auf 37 °C ein, indem Sie denselben Bildschirm für die Gaseinstellung verwenden. Außerdem sollte die Bodentemperatur der Prozesskammer auf 37 °C eingestellt werden.
   7. Klicken Sie auf die Inkubationsmodul-Bänke unter jedem Inkubator. Stellen Sie die Temperatur der Bänke auf 37 °C ein.
2. Betrieb von Pufferkammern
   1. Sammeln Sie zu Beginn alle für die jeweilige Aufgabe (Füttern, Spalten, Färben usw.) erforderlichen Materialien, um eine Verzögerung des Arbeitsablaufs zu vermeiden. Besprühen Sie alle Materialien großzügig mit 70% Ethanol und lassen Sie sie in der Laminarhaube trocknen. Sprühen Sie keine Kolben oder Platten mit Zellen – wischen Sie sie vorsichtig mit einem sterilen Mullschwamm ab, der mit 70 % Ethanol getränkt ist.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Außen- und Innentüren der Pufferkammer sicher verschlossen sind. Öffnen Sie dann die Außentür und legen Sie die Gegenstände hinein.
   3. Schließen Sie die Außentür. Wählen Sie das Puffermodul in der Software aus und klicken Sie auf die Registerkarte Verdünnungsfaktor. Geben Sie einen in das Feld für den logarithmischen Faktor ein. Klicken Sie auf start.
      Hinweis: Ein "Verdünnungsfaktor" bedeutet, dass die Atmosphäre des Puffermoduls evakuiert und einmal durch sauberes, HEPA-gefiltertes Gas ersetzt wird.
   4. Sobald die grafische Benutzeroberfläche aufhört zu blinken, öffnen Sie die Innentür der Pufferkammer und bringen Sie die Materialien in die Prozesskammer.
      Achtung: Lassen Sie die Innen- und Außentür nicht gleichzeitig geöffnet sein und öffnen Sie die Innentür nicht, wenn die Pufferkammer keinen Verdünnungsfaktor durchlaufen hat.
   5. Entfernen Sie zunächst Gegenstände aus der Prozesskammer und stellen Sie sicher, dass die Pufferkammer einen Verdünnungsfaktor durchlaufen hat. Öffnen Sie dann die Innentür, legen Sie die zu entfernenden Gegenstände hinein und schließen Sie die Innentür. Öffnen Sie dann die Außentür und entfernen Sie die Gegenstände.
      Hinweis: Vor dem Öffnen der Außentür darf kein Verdünnungsfaktor ausgeführt werden.

2. Zellen einführen und füttern

1. Einrichtung des Inkubators
   1. Stellen Sie 3 Petrischalen in die Wasserschale am Boden jedes Inkubators. Füllen Sie diese Schalen mit sterilem Wasser und füllen Sie die Pfanne nicht direkt. Halten Sie den Wasserstand in diesen Schalen aufrecht, da sie für die Einhaltung des Sollwerts der relativen Luftfeuchtigkeit (RH) der Inkubatoren entscheidend sind.
   2. Klicken Sie in der grafischen Oberfläche auf den Inkubator. Klicken Sie unter dem Sollwert auf den vorhandenen Wert für die relative Luftfeuchtigkeit (RH) und geben Sie 85 % ein. Klicken Sie auf das grüne Häkchen, um diesen Wert zu übernehmen.
2. Vorbereitung der Zellproduktionsanlage für Zellen
   1. Falls noch nicht geschehen, passen Sie die Pufferkammern, die Prozesskammer und einen Inkubator an die Gassollwerte an, die für den einzuführenden Zelltyp erforderlich sind.
   2. Reinigen Sie die Oberfläche der Prozesskammer mit steriler Gaze und einem nicht brennbaren Desinfektionsmittel. Verwenden Sie kein Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis; In einem geschlossenen System sind die starken, verweilenden Dämpfe giftig für Säugetierzellen. Verwenden Sie stattdessen Produkte auf Benzalkoniumchlorid-Basis.
   3. Setzen Sie die Desinfektion fort. Reinigen Sie die Handschuhe und Oberflächen, die häufig berührt werden, wie z. B. Türgriffe. Verwenden Sie das Desinfektionsmittel gründlich, aber sparsam, da überschüssige Flüssigkeit in der Prozesskammer zu Feuchtigkeit, Kondensation und möglichem mikrobiellem Wachstum beiträgt.
   4. Reinigen Sie die Oberfläche der Laminar-Flow-Haube und der Pufferkammer mit 70 % Ethanol und lassen Sie es trocknen. Legen Sie den Kolben oder die Platte mit den Zellen (in unserem Fall PSCs (pluripotente Stammzellen) oder NSCs (neurale Stammzellen)) in die Haube und wischen Sie die äußere Oberfläche kurz mit einem sterilen, mit Ethanol getränkten Mullschwamm ab.
   5. Der Kolben oder die Platte wird in die Pufferkammer gestellt und ein Verdünnungsfaktor (Schritt 1.2.3) ermittelt.
   6. Nach Ablauf des Verdünnungsfaktors ist der Kolben oder die Platte sofort in den entsprechenden Inkubator zu stellen. Da sich die Inkubatoren im hinteren Teil der Prozesskammer befinden, ziehen Sie ein Regal in die Prozesskammer, um die Zellen zu platzieren. Vermeiden Sie es, die Inkubatortüren unnötig oder über längere Zeiträume zu öffnen, da die Luft in der Prozesskammer im Vergleich zu den Inkubatoren sehr trocken ist und dies zu einem erheblichen Feuchtigkeitsverlust im Inkubator führt.
3. Füttern von Zellkulturen
   1. Sammeln Sie mittlere Komponenten, wie z. B. serologische Pipetten, eine elektronische Pipette, Gaze und Desinfektionsmittel. Sammeln Sie außerdem einen Abfallbehälter für das verbrauchte Zellkulturmedium, aber füllen Sie ihn nicht mit Bleichmittel. Die Materialien werden durch eine Pufferkammer in die Prozesskammer gebracht, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Ordnen Sie Materialien an, um einen optimalen Arbeitsbereich zu ermöglichen. Vermeiden Sie es, nicht verwendete Gegenstände in der Mitte der Prozesskammer zu platzieren.
   2. Lassen Sie den Medienbehälter leicht geöffnet, damit sich das Medium mit den im System vorhandenen CO_{2 -} und O₂ -Werten ausgleichen kann. Einige Hersteller von PSC-Medien geben an, Medien nicht bei 37 ºC zu erwärmen; Wenn ja, verwenden Sie eine Pufferkammer, um das Medium auszugleichen. Lassen Sie das Medium 20 Minuten lang im Gleichgewicht sein.
   3. Entnehmen Sie das alte Medium mit einer geeigneten stereologischen Pipette und einer elektronischen Pipette aus den Vertiefungen. Bei PSCs ist das alte Medium bis auf eine kleine Restmenge zu entfernen, um ein Austrocknen während des Fütterungsprozesses zu verhindern. Bei NSCs entfernen Sie die Hälfte des alten Mediums. Pipettieren Sie den Abfall in den Abfallbehälter.
   4. Legen Sie die gebrauchte Pipette wieder in ihre ursprüngliche Hülle und bringen Sie sie an die Seite der Prozesskammer oder in eine Pufferkammer, die für die Abfallentfernung vorgesehen ist. Geben Sie mit einer frischen sterilen serologischen Pipette frisches Medium in die Zellkulturplatten und setzen Sie die Platten wieder in den dafür vorgesehenen Inkubator ein.
   5. Sprühen Sie die Gaze am Ende der Fütterung mit Desinfektionsmittel ein und reinigen Sie den Boden und die Türgriffe der Prozesskammer gründlich. Wenn mehrere Zelllinien im System gezüchtet werden, sterilisieren Sie zwischen der Fütterung jeder Zelllinie. Dies trägt dazu bei, das Risiko einer Kreuzkontamination zu minimieren.
   6. Entfernen Sie Abfälle oder andere nicht benötigte Gegenstände nach Fertigstellung durch eine der Pufferkammern.

>3. Zellkulturen aufteilen

1. Enzymatische Passage von PSCs oder NSCs
   1. Sammle alle Gegenstände, die du zum Passieren brauchst. Dazu gehören Medien, Enzym- oder nicht-enzymatische Zelldissoziationspuffer (letzterer ist nur für NSCs), DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), Platten oder Kolben, extrazelluläre Matrix (ECM), konische Röhrchen und serologische Pipetten. Bringen Sie sie über eine Pufferkammer in das System.
   2. Beschichten Sie frische Platten oder Kolben mit ECM, wie bereits beschrieben 9,10. Einige ECMs - wie z. B. solche, die aus Maussarkom-Zelllinien gewonnen werden - sind nur zwischen 4 und 15 °C flüssig, verwenden Sie daher einen sterilisierten Kälteblock oder einen Gel-Eisbeutel, um die EZM kalt zu halten, während Sie in der beheizten Prozesskammer arbeiten.
   3. Pipettieren Sie das verbrauchte Medium aus der Kultur ab und entsorgen Sie es im Abfallbehälter.
   4. Spülen Sie die Vertiefung oder die Kolbenoberfläche mit 1 ml DPBS/Vertiefung und entsorgen Sie das DPBS.
   5. 1 - 2 ml warmes Enzym in jede Vertiefung geben. Nur sehr dichte Kulturen benötigen 2 ml.
   6. Bewegen Sie die Kulturschale oder den Kolben sofort in die Mikroskopkammer und beobachten Sie die Kultur. Achten Sie auf Anzeichen dafür, dass sich einzelne Zellen von der Schale lösen. Warten Sie nicht, bis die Zellen in Suspension schwimmen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   7. Bringen Sie die Zellen wieder in die Hauptprozesskammer zurück. Fügen Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 4 ml DPBS pro 1 ml Enzym hinzu und pipettieren Sie dann kräftig auf und ab, um die Zellen von der Well-Oberfläche zu entfernen. Wenn Sie mehrere Vertiefungen innerhalb einer mehrwandigen Platte durchlaufen, fügen Sie das DPBS zu jeder Vertiefung hinzu, bevor Sie die Zellen aus den einzelnen Vertiefungen entfernen.
   8. Übertragen Sie das Enzym und die PBS-Zellsuspension in ein konisches Röhrchen geeigneter Größe.
   9. Wenn in der Zellproduktionsanlage keine Zentrifuge verfügbar ist, verschließen Sie das konische Röhrchen fest, stellen Sie es in eine Pufferkammer und verschließen Sie die Tür.
   10. Entfernen Sie das konische Röhrchen aus der Pufferkammer von der Laminar-Flow-Seite und drehen Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min bei RT.
   11. Besprühen Sie das konische Rohr mit 70% Ethanol und bringen Sie es mit einer Pufferkammer und einem Verdünnungsfaktor in die Prozesskammer.
   12. Der Überstand wird abpipetiert und die Zellen werden in 2 ml PSC- oder NSC-Medium resuspendiert. Bei der Passage von PSCs ist der ROCK-Inhibitor (Rho-assoziierte Proteinkinase) in einer Konzentration von 10 μM in das Medium aufzunehmen.
   13. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie die erforderlichen Vertiefungen oder Platten. PSCs bei 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ Zellen/cm² plädieren. Teilen Sie die NSCs im Verhältnis 1:2 auf.
       Hinweis: NSCs verklumpen oft und widersetzen sich einer genauen Zählung in einem Hämozytometer.
   14. Wenn eine Kryokonservierung der Zellen erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass alle Vorräte und Gefriermedien vorbereitet und in der Prozesskammer platziert sind. DMSO (Dimethylsulfoxid) ist bei 37 ºC sehr giftig für die Zellen und wirkt daher schnell. Halten Sie den mit Isopropanol ummantelten Gefrierbehälter auf RT in der Laminar-Flow-Haube. Sobald die Kryokonservierungsfläschchen gefüllt und verschlossen sind, nehmen Sie sie sofort aus der Prozesskammer, indem Sie sie durch eine Pufferkammer führen.
2. Manuelles Passieren von PSCs
   1. Vergewissern Sie sich, dass die Kultur wie zuvor beschrieben übergeben werden muss. Wenn ja, bereiten Sie frische Platten oder Kolben vor, die mit extrazellulärer Matrix überzogen sind. Wechseln Sie dann das Medium vollständig.
   2. Reinigen Sie die Mikroskopkammer mit steriler Gaze, die mit einer geringen Menge nicht brennbarem Desinfektionsmittel angefeuchtet ist – zu viel Gaze führt zu übermäßigem Beschlagen. Reinigen Sie nur die Handschuhe, den Bodenbereich und die Bühne. Bringen Sie mehrere 200 μl oder 1.000 μl einzeln verpackte Pipettenspitzen in die Kammer.
   3. Bringen Sie die PS-Platte in die Mikroskopkammer, nehmen Sie den Deckel ab und legen Sie sie mit der Vorderseite nach unten auf den frisch gereinigten Boden. Wenn Sie den Deckel oben lassen, ist die Unterseite direkt Luftströmungen und möglicher Verschmutzung ausgesetzt.
   4. Wickeln Sie eine Pipettenspitze aus und nehmen Sie mit dem Mikroskop die Kultur sichtbar und nehmen Sie mit der Spitze der Pipette Kolonien mit guter Morphologie auseinander.
      Hinweis: Die Pipettenspitze kann an einer Pipette befestigt werden, wenn dies für den einzelnen Benutzer bequemer ist.
   5. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte und bringen Sie die Platte zurück in die Prozesskammer.
   6. Pipettieren Sie überschüssiges ECM von der neuen Platte ab und übertragen Sie das Medium von der alten Platte (mit den Koloniestücken in Suspension) auf die neue Platte. Wenn die alte Platte noch Völker enthält, die noch nicht zur Pflücke bereit sind, füttern Sie diese ebenfalls.

Ergebnisse

Abbildung 1. Grafische Oberfläche für die Zellfertigung. (A) Die grafische Darstellung des CPF ist der Standardbildschirm und stimmt mit der in Abbildung 3 gezeigten CAD-Zeichnung überein. Ein Mausklick auf das Puffermodul 1 öffnet dessen Steuerbild (B), auf dem die O_2-Werte so eingestellt werden, dass sie der Verarbeitungskammer entsprechen. Wenn Sie a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Xvivo System	Biosphärix	Sonderanfertigung
Xvivo Software	Biosphärix	Version I.O.2.1.2.1
O2-Verteiler	Amico	P-M2H-C3-S-U-OXY
CO2-Krümmer	Amico	M2H-C3-D-U-CO2
N2 Verteiler	Westlicher Innovator	CTM75-7-2-2-BM
O2-Gas
CO2-Gas
N2 Gas
Petrischale
Wasser
Sterile Gaze
70% Ethanol	BDH	BDH1164-4LP
Desinfektionsmittel auf Benzalkoniumchlorid-Basis
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco
Hank-basierter Zelldissoziationspuffer	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 13150-016
Serologische Pipette / 2 ml	VWR	Nr. 89130-894
Serologische 5-ml-Pipette	Olympus Kunststoffe	Nr. 12-102
10 ml serologische Pipette	Olympus Kunststoffe	Nr. 12-104
25 ml serologische Pipette	Olympus Kunststoffe	Nr. 12-106
50 ml serologische Pipette	Olympus Kunststoffe	Nr. 12-107
6-Well-Platte	Corning	353046
20 μl Pipettenspitzen	Eppendorf	22491130
200 μl Pipettenspitzen	Eppendorf	22491148
1000 Pipettenspitzen	Eppendorf	22491156
Mikroskop mit DP21 Kamera und Fluoreszenz	Olympus Corporation	CKX41
Phosphatgepuffertes Natrium	Hyklon	9236
Dimethylsulfoxid	Protide	PP1130
Handschuhe