Aufreinigung von CD31+ endothelialen Vorläuferzellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Abstract

Quelle: Matsuo, K., et al. Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären endothelzellähnlichen Zellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp. J. Vis. Exp. (2023).

Dieses Video zeigt eine Technik zur Aufreinigung von CD31⁺ endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) aus einer Kultur mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS). Die Zellsuspension wird mit einem Fluorophor-konjugierten Antikörper behandelt, der an CD31 auf den EPCs bindet. Um die Markierung von CD31⁺ EPCs abzuschließen, müssen ein Antikörperkomplex, der an die Fluorophore bindet, und ein polymerbeschichtetes magnetisches Nanopartikel, das an den Antikörperkomplex bindet, hinzugefügt werden. Die markierten Zellen werden dann mit einem Magnetfeld gereinigt, wobei alle ^CD31-Zellen verworfen werden.

Protocol

Die humane induzierte pluripotente Stammzelllinie (hiPSC), HPS1006, wurde vom RIKEN BRC im Rahmen des National Bio-Resource Project des MEXT/ AMED, Japan, zur Verfügung gestellt.

>1. Induktion der hiPSC-Differenzierung in endotheliale Vorläuferzellen (EPCs)

1. Mit extrazellulärer Matrix (ECM) beschichtete Platten und Reagenzien
   1. Bereiten Sie 12-Well-Platten mit Basalmembranmatrix vor, indem Sie 2,5 mg Matrixgel in 50-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotieren, die bis zu 6 Monate lang bei -20 °C gelagert werden können. Geben Sie 30 mL kaltes Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12), das im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt wurde, in das Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren, bis das Gel aufgetaut ist, und geben Sie dann 500 μl der Lösung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte. Stellen Sie die Platte für mindestens 1 h.
      in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) Anmerkung: Das Basalmembran-Matrix-Gel ist temperaturempfindlich und sollte gemäß den Herstellerangaben für die Aliquotierung und Plattenbeschichtung gehandhabt werden. Die Konzentration von Proteinen der extrazellulären Matrix kann zwischen den Chargen variieren. Um die Genauigkeit zu gewährleisten, sollte die genaue Konzentration auf dem Qualitätszertifikat für die jeweilige Charge unter Verwendung der Chargennummer angegeben werden. Wenn die genaue Konzentration beispielsweise 10,0 mg/ml beträgt, verwenden Sie 250 μl Gel für insgesamt 2,5 mg.
   2. Bereiten Sie eine Stammlösung für Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitoren vor, indem Sie den ROCK-Inhibitor in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 10 mM auflösen (Tabelle 1). Aliquotieren Sie die Stammlösung in Volumina von 100-200 μl und lagern Sie sie bei -20 °C, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
   3. Eine 100 mg/ml-Stammlösung L-Ascorbinsäure herstellen, indem 5 g L-Ascorbinsäure in 50 ml sterilem Wasser gelöst und bei -20 °C gelagert werden (Tabelle 1). Fügen Sie 6,25 ml Glutamin und 305 μl L-Ascorbinsäure-Stammlösung in 500 ml fortschrittliches DMEM/F12 hinzu, um ein LaSR-Medium herzustellen (Tabelle 1). Bei 2-8 °C bis zu 2 Wochen lagern.
   4. Bereiten Sie CHIR99021 Lösung vor, indem Sie CHIR99021 in unverdünntem Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 10 mM auflösen (Tabelle 1). Aliquotieren Sie die Lösung in Volumina von 100-200 μl, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, und lagern Sie sie bis zu 1 Jahr lang bei -20 °C. Die Arbeitsaliquote der Stammlösung werden bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert.
   5. Bereiten Sie DMEM/F12-10-Medium vor, indem Sie 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum zu 450 ml DMEM/F12 hinzufügen. Lagern Sie das Medium bei 2-8 °C bis zu 1 Monat (Tabelle 1).
   6. Bereiten Sie den Fließpuffer-1 vor, indem Sie 33,3 ml 7,5 % Rinderserumalbumin (BSA) zu 467 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen (Tabelle 1). Bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
2. Seeding von singularisierten hiPSCs und Expansion zur EPC-Differenzierung (Tag -3 bis Tag -1)
   1. Beginnen Sie mit der Differenzierung, wenn die hiPSC-Kolonien in einer 6-Well-Platte keine spontane Differenzierung zeigen und die geeignete Dichte für die Passage aufweisen, typischerweise etwa 80% Konfluenz (2,5-3,5 x 10⁶ Zellen). Überwachen Sie spontan differenzierte Zellen sorgfältig unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, ob mehrere Passagen erforderlich sind, um nicht differenzierte Zellen zu eliminieren. Informationen zum Zellkulturmedium und zur extrazellulären Matrix finden Sie im Hinweis unter Schritt 1.4.15.
   2. Aspirieren Sie das Medium, geben Sie 1 ml Dissoziationsreagenz in die Vertiefungen und inkubieren Sie es 5-7 Minuten lang bei 37 °C. Dissoziieren und vereinzeln Sie die Zellen, indem Sie die Dissoziationsreagenzlösung zwei- oder dreimal vorsichtig über die Oberflächen der Vertiefungen pipettieren.
   3. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein 15-ml-Röhrchen mit 4 ml hiPSC-Erhaltungsmedium und resuspendieren Sie die Zellen gründlich. Reservieren Sie ein 10-μl-Aliquot für die Zellzählung.
   4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 200 x g bei 20-25 °C. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie das erforderliche Volumen, um eine angemessene Dichte von hiPSCs (75-400 x 10³ pro Well) in einer mit Basalmembranmatrix beschichteten 12-Well-Platte zu erreichen (Schritt 1.1.1).
   5. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung aus den Vertiefungen und geben Sie 1 ml hiPSC-Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor in jede Vertiefung (1:1.000 Verdünnung). Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand aspiriert und das Pellet in 1 ml hiPSC-Medium dissoziiert.
   6. Geben Sie das erforderliche Volumen an hiPSC, das in Schritt 1.2.4 bestimmt wurde, in jede Vertiefung der 12-Well-Platte. Zwei bis vier 12-Well-Platten können für die Differenzierung eines hiPSC-Klons ausreichend sein. In Schritt 1.2.4 ist die Anzahl der Platten zu bestimmen, die für die Aussaat der Zellen erforderlich sind.
   7. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO²). Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Platte vorsichtig hin und her und dann von einer Seite zur anderen im Inkubator schieben.
   8. Tauschen Sie das Medium am folgenden Tag (d. h. Tag -2) gegen 2 ml hiPSC-Erhaltungsmedium ohne ROCK-Inhibitor aus. Tauschen Sie das Medium am nächsten Tag (Tag -1) durch 2 mL frisches hiPSC-Erhaltungsmedium aus.
3. Induktion von EPCs mit dem Glykogensynthase-Kinase-3-Inhibitor (GSK-3) CHIR99021 (Tag 0 bis Tag 5)
   1. Ersetzen Sie an Tag 0 das hiPSC-Erhaltungsmedium in jeder Vertiefung durch 2 ml LaSR-Medium mit 8 μM CHIR99021.
   2. An Tag 1 aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 2 ml frisches LaSR-Medium mit 8 μM CHIR99021 hinzu.
   3. Ersetzen Sie an den Tagen 2, 3 und 4 das Medium durch 2 ml frisches LaSR-Medium ohne CHIR99021.
4. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) zur Aufreinigung von CD31+ EPCs (Tag 5)
   1. An Tag 5 wird das Medium aspiriert und dann 1 ml Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung gegeben, bevor es 6-8 Minuten bei 37 °C inkubiert wird.
   2. Dissoziieren und vereinzeln Sie die Zellen mit einer Mikropipette und passieren Sie ein 40-μm-Zellsieb, um die Suspension in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml DMEM/F12-10-Medium zu filtrieren. Filtrieren Sie die von mehr als zwei 12-Well-Platten gesammelte Zellsuspension in mindestens zwei 50-ml-Röhrchen.
   3. Stoppen Sie die Aufschlussreaktion durch Zugabe von DMEM/F12-10-Medium (bis zu 50 ml). Gründlich pipettieren und 10 μl für die Zellzählung reservieren. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie 5 min bei 200 x g bei 20-25 °C zentrifugieren.
   4. Nach Entfernen des Überstands werden 10 ml DMEM/F12-10-Medium zugegeben und die Zellsuspension in frische 15-ml-Röhrchen überführt. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie 5 min bei 200 x g bei 20-25 °C zentrifugieren.
   5. Der Überstand wird aspiriert und in den Strömungspuffer-1 mit einer Dichte von 1,0 x 10⁷ Zellen pro 100 μl Puffer resuspendiert.
   6. Geben Sie das FcR-blockierende Reagenz (FcR) in einem Verhältnis von 1:100 hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang, bevor Sie den mit Fluorescein isothiocyanat (FITC) markierten CD31-Antikörper hinzufügen, der 1:200 verdünnt ist. Inkubieren Sie die Suspension 30 min lang im Dunkeln bei 20-25 °C.
   7. Fügen Sie 10 ml Flusspuffer-1 hinzu und reservieren Sie 10 μl der Suspension für die durchflusszytometrische Analyse, um den Anteil der CD31⁺-Zellen zu bestimmen (Abbildung 1).
   8. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min bei 20-25 °C. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie auf eine Dichte von 1,0 x 10⁷ Zellen pro 100 μl Fließpuffer-1-Lösung. Fügen Sie den FITC-Auswahlcocktail hinzu (5 μl pro 100 μl Zellsuspension). Durch Pipettieren gründlich mischen und 15 min bei 20-25 °C im Dunkeln inkubieren.
   9. Fügen Sie 5 μl magnetische Nanopartikel pro 100 μl Zellsuspension hinzu, pipettieren Sie es gut und inkubieren Sie es 10 Minuten lang im Dunkeln bei 20-25 °C.
   10. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-ml-Durchflusszytometrieröhrchen und fügen Sie Flusspuffer-1 hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2,5 mL zu erreichen. Legen Sie das Durchflusszytometrie-Röhrchen für 5 Minuten in den Magneten.
   11. Drehen Sie den Magneten in einer kontinuierlichen Bewegung um und dekantieren Sie die Zellsuspension, die Zellen enthält, die nicht mit dem FITC-CD31-Antikörper markiert wurden. Halten Sie den Magneten und das Rohr 2-3 s lang in der umgekehrten Position und entfernen Sie dann die restliche Flüssigkeit. Saugen Sie alle Tröpfchen am Rand des Schlauchs an, bevor Sie den Schlauch wieder in eine aufrechte Position bringen.
   12. Nehmen Sie das Durchflusszytometrie-Röhrchen vom Magneten und fügen Sie 2,5 ml Flusspuffer-1 hinzu, um die verbleibenden CD31⁺-Zellen zu waschen. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Zellen zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Setzen Sie den Durchflussschlauch für 5 Minuten in den Magneten ein.
   13. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.11 bis 1.4.12 dreimal und dann Schritt 1.4.11 noch einmal für insgesamt vier Wäschen.
   14. Entfernen Sie das Durchflussröhrchen vom Magneten und geben Sie die angegebene Menge eines geeigneten Mediums (z. B. humanes endotheliales serumfreies Medium [hECSR] für die erweiterte EC-Kultur oder Gefriermedium zum Einfrieren) in das Röhrchen, um die gereinigten CD31⁺-Zellen zu resuspendieren. Reservieren Sie zwei 10-μl-Aliquots der Suspension, eines für die Zellzählung und das zweite für die Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse zur Beurteilung der Reinheit von CD31⁺-Zellen in Post-MACS-Proben (Abbildung 1). Wenn nicht sofort ein Durchflusszytometer zur Verfügung steht, lagern Sie das Aliquot bis zur Analyse bei 4 °C.
   15. Frieren Sie die CD31+ EPCs an dieser Stelle ein.
       Anmerkung: Vitronectin-beschichtete 12-Well-Platten und das stabilere hiPSC-Erhaltungsmedium (mTeSR plus) können anstelle von Basalmembranmatrix-beschichteten Platten und hiPSC-Erhaltungsmedium (mTeSR1) verwendet werden. Zur Herstellung von vitronectinbeschichteten 12-Well-Platten verdünnen Sie Vitronektin mit Verdünnungspuffer auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml und übertragen Sie dann 500 μl der verdünnten Lösung in jede Vertiefung der 12-Well-Platten. Lassen Sie die Platten mindestens 1 h bei 20-25 °C stehen. Die Aussaatdichte von singularisierten hiPSCs ist vergleichbar mit der von Basalmembranmatrix-beschichteten Platten. Eine Änderung des Kulturmediums oder der Matrixzusammensetzung kann sich auf die Proliferation und spontane Differenzierung von hiPSCs auswirken, die in der Regel 1-2 Wochen benötigen, um sich an neue Kulturbedingungen anzupassen. Wird für die hiPSC-Pflege das stabilere hiPSC-Erhaltungsmedium verwendet, kann dieses Medium anstelle des hiPSC-Erhaltungsmediums zur EPC-Differenzierung verwendet werden. In diesem Fall sollte das stabilere hiPSC-Erhaltungsmedium an Tag -2 gewechselt werden, um den ROCK-Inhibitor zu entfernen, und der Austausch an Tag -1 kann übersprungen werden.

Results

Tabelle 1: Details zu spezifischen Reagenzien für die Assays. Der Name und die genaue Menge der Inhaltsstoffe für jedes spezifische Reagenz werden beschrieben.

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Spezifisches Reagenz	Bestandteil	Volumen
Essigsäure, 0,5 mg/ml Lösung	Essigsäure

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 mm Spritzenvorsatzfilter	Wärmekraftwerk	Artikel-Nr.: 99722
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falke	352196
40 μm Falcon Zellsieb	Falke	Artikel-Nr.: 352340
5 mL Röhrchen mit rundem Boden	Spl	Nr. 40005
50 mL Zentrifugenröhrchen	Falke	Artikel-Nr.: 352070
96-Well-Platte, runder Boden	Spl	Artikel-Nr.: 34096
Accutase	Sigma-Aldrich	Nr. A6964-500ml
Essigsäure	Sigma-Aldrich	695092
Erweitertes DMEM/F12	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12634
All-in-One-Fluoreszenzmikroskop	Keyence	BZ-X810
B-27 Supplement (503), serumfrei	Thermo Fischer Scientific	17504044
Rinderserumalbumin (BSA), 7,5 % in dPBS	Sigma-Aldrich	Nr. A8412
CellAttach Verdünnungspuffer	STEMCELL-Technologien	Nr. ST-07183
CHIR99021	Selleck Chemikalien	Nr. S1263
Kollagen IV aus der menschlichen Plazenta	Sigma-Aldrich	Nr. C5533
Corning Gewebekulturplatten (12 Wells)	Corning	Nr. 3512
Corning Gewebekulturplatten (6 Wells)	Corning	3506
Innenkappe für Kryo-Röhrchen 2,0 mL	Watson	1396-201S
Dimethylsulfoxid (DMSO), steril	Sigma-Aldrich	Nr. D2650
DMEM (13), [+] 4,5 g/L D-Glukose, [-] L-Glutamin, [-] Pyruvat	Thermo Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 31053-028
Dulbecco's (d) PBS (ohne Calcium,Magnesium)	Thermo Fischer	14190250
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC Positivauswahl-Kit II	STEMCELL-Technologien	Nr. 18558
EasySepMagnet	Stammzellen-Technologien	Nr. 18000
Ethylendiamintetraessigsäurelösung0,02 % in DPBS	Sigma	E8008-100ML
Fötales Rinderserum, qualifiziert	Thermo Fischer Scientific	10270106
HEPES-Pufferlösung	Thermo Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 15630-056
Freies Medium für humanes Endothelserum (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 11111-044
Humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)	Tocris	Artikel-Nr.: 233-FB-500
iPS humane induzierte pluripotente Stammzellen	Riken RBC	HPS1006
Kanamycinsulfat (100x)	Thermo Fischer Scientific	Tel.: 15160-047
L-Ascorbinsäure, 2-Phosphat, Sesquimagnesiumsalz, Hydrat	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamin 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 25030-024
Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert	Corning	Artikel-Nr.: 354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	Tel.: 11140-035
ROCK-Inhibitor Y-27632	Tocris	Nr. 1254
RPMI Medium 1640 Tris Sockel	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100