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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung des Stammmediums und Rückgewinnung von Stammzellen
- Bereiten Sie die Nährmittelbrühe (DFHGPS) vor, indem Sie die Reagenzien in den Schritten 1.1.1.-1.1.5 kombinieren.
- Fügen Sie 210 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium mit hohem Glukose- und L-Glutamingehalt (D) hinzu. Bei 4 °C lagern.
- Fügen Sie 70 ml der F12-Nährstoffmischung von Ham mit L-Glutamin-Ergänzungsmittel (F) hinzu. Bei 4 °C lagern.
- Fügen Sie 4,2 mL 15 mM HEPES-Puffer (H) hinzu und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 4,2 ml 10%ige D-Glukoselösung (G) hinzu und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 2,88 ml Penicillin/Streptomycin (PS) -Lösung hinzu. Die Stammlösung wird in 3-ml-Aliquote aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
Anmerkung: Die Endkonzentration von Penicillin im Medium beträgt 100 Einheiten/ml und die Konzentration von Streptomycin beträgt 100 μg/ml. Dieses Medium wird für den Rest des Protokolls als DFHGPS bezeichnet und sollte bei 4 °C gelagert werden, um innerhalb von 1-2 Wochen verwendet werden zu können. Bei Bedarf kann DFHGPS proportional hochskaliert werden.
- Am Tag vor der Zellgewinnung wird ein T75-Kolben mit 5 ml konditioniertem Medium bestrichen, das aus früheren Kulturen der hNSC-Zelllinie gewonnen wurde, und über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 8,5 % Kohlendioxid (CO2) belassen.
Anmerkung: Wenn Sie derzeit hNSCs kultivieren, bewahren Sie das Medium auf, in dem die Zellen während eines Mediumwechsels gewachsen sind. Dabei handelt es sich um ein konditioniertes Medium, wie es von den Zellen "konditioniert" wurde. Das konditionierte Medium kann in einem Schraubverschlussröhrchen aufbewahrt und bei 4 °C für ca. 7 Tage gelagert werden. Wenden Sie sich an den korrespondierenden Autor, um hNSCs zu erhalten. Konditioniertes Medium wird bevorzugt, ist aber nicht zwingend erforderlich, insbesondere wenn die Kultur von hNSCs zum ersten Mal beginnt.
- Erwärmen Sie am Tag der Genesung 20 mL DFHGPS in einem 50 mL Schraubverschlussröhrchen in einem 37 °C Wasserbad für mindestens 10 Minuten und bewahren Sie es bis zur Verwendung im Wasserbad auf.
- In einem separaten 15-ml-Schraubverschlussröhrchen 10 mL DFHGPS in einem 37 °C warmen Wasserbad für mindestens 10 min erwärmen und bis zur Verwendung in Schritt 1.13 im Wasserbad aufbewahren.
- Holen Sie einen Behälter mit Eis und allen Bestandteilen des Mediums heraus (Tabelle 1). Tauen Sie alle Mediumkomponenten auf dem Eis auf und lassen Sie sie auf dem Eis, während Sie sich auf den Mediumwechsel vorbereiten.
- Besorgen Sie sich 5 ml konditioniertes Medium (gelagert bei 4 °C) und bewahren Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, bis es in Schritt 1.14 verwendet werden kann. Siehe Anmerkung nach Schritt 1.2, wenn kein konditioniertes Medium oder keine aktuelle humane fetale neurale Stammzellkultur vorhanden ist.
- Nehmen Sie das 50-ml-Schraubverschlussröhrchen aus Schritt 1.3 und legen Sie es in die Biosicherheitswerkbank (BSC). Übertragen Sie 10 mL DFHGPS in ein neues 15 mL Schraubverschlussröhrchen und legen Sie dann das 50 mL Röhrchen mit den restlichen 10 mL DFHGPS Medium zurück in das 37 °C Wasserbad.
- Besorgen Sie sich ein Kryo-Fläschchen mit hNSCs, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Siehe Anmerkung nach Schritt 1.2, wenn derzeit keine humane fetale neurale Stammzellkultur vorhanden ist.
Anmerkung: Menschliche neurale Stammzellen wurden ursprünglich aus verworfenen menschlichen fötalen Gehirnen gewonnen12 und ohne genetische Veränderungen in Kultur gehalten10. 5 × 106 Zellen sollten aufgetaut und auf einem T75-Kolben plattiert werden. Jedes Kryo-Fläschchen sollte 5 × 106 Zellen enthalten; Daher wird ein Fläschchen pro Kolben benötigt.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, indem Sie das Fläschchen alle 10 s für ca. 1 min umdrehen oder bis das Eis geschmolzen ist und der Inhalt des Fläschchens vollständig flüssig ist. Tauchen Sie nicht die gesamte Durchstechflasche unter Wasser, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden.
- Verwenden Sie in der BSC eine P1000-Mikropipette, um die aufgetaute Zelllösung zu aspirieren, und geben Sie sie tropfenweise in das 15-ml-Röhrchen aus Schritt 1.7, das 10 ml DFHGPS enthält. Um die aufgetaute Zelllösung tropfenweise hinzuzufügen, drücken Sie langsam auf den Kolben, so dass nur ein oder zwei Tropfen auf einmal freigesetzt werden. In der Zwischenzeit das 15-ml-Röhrchen schwenken, um eine schnelle Mischung zu ermöglichen.
- Die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass das Zellpellet erhalten bleibt.
- Entnehmen Sie in Schritt 1.11 das 50-ml-Röhrchen mit den restlichen 10 mL aus Schritt 1.7. Nach der Zentrifugation das Zellpellet im 10 mL DFHGPS resuspendieren und erneut bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Bereiten Sie während des letzten Spins das neue Wachstumsmedium vor, indem Sie Tabelle 1 befolgen, um den 10 ml DFHGPS-Medium aus Schritt 1.4 (Tabelle 1) in BSC Wachstumsfaktoren hinzuzufügen. Lassen Sie das neue Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, bis zur Verwendung in der BSC.
- Der Kolben T75 wird aus Schritt 1.2 entnommen und das konditionierte Medium, das den Kolben durch Aspiration bedeckt, entsorgt. Fügen Sie dann die 5 mL des konditionierten Mediums aus Schritt 1.6 hinzu. mit einer serologischen Pipette in den Kolben geben. Achten Sie darauf, den Boden des Kolbens nicht zu zerkratzen.
- Nehmen Sie das Röhrchen mit den Zellen aus der Zentrifuge und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn ansaugen, wobei das Zellpellet intakt bleibt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL neuem Medium aus Schritt 1.13, indem Sie eine serologische 5-ml-Pipette verwenden und mehrmals auf und ab pipettieren. Die Suspension wird in den beschichteten T75-Kolben aus Schritt 1.14 gegeben. Verwenden Sie die restlichen 5 ml, um das Röhrchen mit dem Zellpellet zu spülen, und geben Sie dann diese 5 ml ebenfalls in den Kolben.
- Bewegen Sie den T75-Kolben 3 Mal hin und her, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den Kolben verteilt sind. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Kolbens locker ist, um den Luftstrom zu ermöglichen. Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, machen Sie sich Notizen und machen Sie nach Möglichkeit Bilder.
Anmerkung: Die Zellen sollten durchscheinend und kugelförmig aussehen. Notieren Sie sich, ob es Zellen gibt, die dunkel oder undurchsichtig aussehen oder asymmetrische Ränder haben, da dies auf den Zelltod hinweisen kann. Achten Sie auch auf Pilz- oder Bakterienkontaminationen, z. B. wenn sich die Medien gelb verfärben.
- Den Zellkolben in einen 37 °C heißen Inkubator mit 8,5 % CO2,
stellen
Anmerkung: Verwenden Sie 8,5 % anstelle von 5,0 % CO2, um den pH-Wert dieses serumfreien Nährmediums im Bereich von 7,1 bis 7,4 zu halten.
>2. hNSC Mittlere Änderung
HINWEIS: Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.
- Schalten Sie den BSC ein und reinigen Sie ihn gründlich mit 70% Ethanol. Beobachten Sie Zellen unter einem Lichtmikroskop.
Anmerkung: Machen Sie sich Notizen zum Aussehen der Zellen und Kugelgrößen. Drei Tage nach der Genesung oder Passage gruppieren sich die Zellen und beginnen, nicht adhärente Neurosphären zu bilden.
Vorsicht: Wenn Zellen am Boden des Kolbens haften, muss die Kultur verworfen werden, da die Zelladhärenz die vorzeitige Differenzierung erhöht und die Zellen nicht in der Lage sind, einen Stammzustand aufrechtzuerhalten. Wenn sich zu viele Zellen im Kolben befinden, können die Zellen große Kugeln (mit einem Durchmesser von mehr als 2 mm) bilden, wobei in diesem Fall die Zellen in der Mitte der Kugel aufgrund des fehlenden Zugangs zu Wachstumsfaktoren im Medium beginnen, sich zu differenzieren. Werden Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 1 mm beobachtet, können Zellen durchgelassen werden (Schritte 3.1-3.22).
- Befolgen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 und bereiten Sie 10 ml frisches Medium vor (siehe Schritt 1.13).
- Kippen Sie den Kolben zur Seite, so dass die Kugeln auf den Boden des Kolbens sinken können.
- Entfernen Sie 5 ml konditioniertes Medium mit einer serologischen 5-ml-Pipette von der Oberseite des gepoolten Mediums und achten Sie darauf, keine Neurosphären zu aspirieren. Geben Sie die 5 ml des konditionierten Mediums in ein sauberes 15-ml-Röhrchen.
- Nehmen Sie weitere 5 ml konditioniertes Medium aus dem Kolben, wobei Sie die Kugeln erneut vorsichtig vermeiden sollten, und geben Sie die 5 ml in dasselbe 15-ml-Röhrchen.
- 10 ml des neuen Mediums aus Schritt 2.2 werden zu den verbleibenden 5 mL des konditionierten Mediums und der Zellen in den Kolben gegeben. Stellen Sie den Kolben flach ab und beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop.
- Wenn es den Anschein hat, dass während der Entnahme des konditionierten Mediums Zellen aspiriert wurden, schleudern Sie das konditionierte Medium 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 100 x g. Alle Zellen, die sich am Boden in 1 ml des konditionierten Mediums ansammeln, werden erneut suspendiert und dann in den Kulturkolben gegeben.
- Lagern Sie die 10 mL unbenutzte konditionierte Medien aus den Schritten 2.5/2.6 bei 4 °C in einem 15-ml-Schraubverschlussröhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.17/1.18.
>3. hNSC-Passage
- Wenn Sie die NSCs in einen neuen Kolben erweitern, stellen Sie sicher, dass alle neuen Kolben wie in Schritt 1.2 beschichtet sind.
- Reinigen Sie die BSC wie in Schritt 2.1 und führen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 durch.
- Bereiten Sie das Medium wie in Schritt 1.13 vor. Jeder T75-Kolben benötigt 10 mL Medium. Multiplizieren Sie bei mehreren T75-Kolben 10 ml Medium mit der Anzahl der Kolben.
- Bereiten Sie entweder 1 oder 3 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (dPBS) und Glukose vor und stellen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad für 10 min (für Trypsinlösung) entsprechend den Volumina in Tabelle 2. Fügen Sie zu diesem Zeitpunkt kein Trypsin oder DNase hinzu. DNase kann erforderlich sein, um die von den toten Zellen freigesetzte DNA aufgrund mechanischer oder chemischer Zelldissoziation abzubauen.
HINWEIS: Für einen T75-Kolben, der nach 9-10 Tagen Wachstum durchgelassen wird, gibt es ungefähr 30 × 106 Zellen, wenn ursprünglich 5 × 106 auf den Kolben gesät wurden. Typischerweise wird 1 ml dPBS-Lösung für 10 × 106 Zellen verwendet. Daher werden 3 ml dPBS-Lösung für einen T75-Kolben benötigt, der nach 9-10 Tagen durchgelassen wird.
- Platzieren Sie ein sauberes kleines Wägeschiffchen und ein Hämozytometer in der Haube. Mit 70% Ethanol reinigen und ca. 5 Min. in der Haube an der Luft trocknen lassen
Anmerkung: Das Wiegeschiff wird in den Schritten 3.17.1 verwendet.
- Entnehmen Sie den Kolben mit den Zellen, die aus dem Inkubator entnommen werden, und bringen Sie ihn in den BSC. Der Kolben wird vorsichtig gekippt, so dass die Zellen auf den Boden des gepoolten Mediums sinken können. Der Kolben enthält etwa 15 ml Medium.
- Entfernen Sie etwa 10 mL des Mediums in 5-ml-Portionen (d. h. 5 mL + 5 mL). Geben Sie diese 10 ml Medium in ein sauberes 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "CM" für "konditioniertes Medium". Es ist darauf zu achten, dass keine der Zellen, die sich in den verbleibenden 5 ml des Mediums im Kolben absetzen, aspiriert werden. Diese Zellen und 5 ml Medium werden Schritt 3.8 unterzogen.
- Entnehmen Sie 3 ml konditioniertes Medium aus dem "CM"-Röhrchen (aus Schritt 3.7) und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Trypsin-Inhibitor-Lösung". Dies wird in Schritt 3.12 verwendet. Nach der Entnahme der 3 ml verbleiben noch 7 ml konditioniertes Medium im "CM"-Röhrchen. Legen Sie die "CM"-Röhre bis Schritt 3.9 beiseite.
- Die 5 ml des im T75-Kolben verbliebenen Mediums und der Zellen werden entfernt und in ein sauberes 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Zellen" gegeben.
- Nehmen Sie das "CM"-Röhrchen mit 7 ml konditioniertem Medium (aus Schritt 3.7.1) und spülen Sie den Boden des T75-Kolbens zweimal mit 3,5 mL Portionen konditioniertem Medium mit einer serologischen 5-ml-Pipette aus. Geben Sie nach jedem Spülen die 3,5-ml-Portionen in das "Cells"-Röhrchen. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, alle Neurosphären (Zellen) aus dem T75-Kolben zu entfernen.
- Das Röhrchen "Cells" bei 100 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Während sich die Zellen drehen, erhalten Sie dPBS/Glukoselösung aus einem 37 °C warmen Wasserbad und fügen Sie die entsprechende Menge Trypsin und DNase gemäß Tabelle 2 hinzu.
- Nachdem sich das "Cells"-Röhrchen nicht mehr dreht, entfernen Sie den gesamten konditionierten Medienüberstand und geben Sie es in das "CM"-Röhrchen.
- Nehmen Sie das Röhrchen mit der Bezeichnung "Trypsin-Inhibitor-Lösung" aus Schritt 3.7.1 und fügen Sie das in Tabelle 3 angegebene Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzu. Verwenden Sie das gleiche Volumen der Trypsin-Hemmerlösung, das für die Trypsin-Lösung verwendet wurde.
- Geben Sie die Trypsin-Inhibitor-Lösung bis zur Verwendung in das 37 °C heiße Wasserbad.
- Geben Sie Trypsinlösung in das Zellpellet im 15-ml-Röhrchen und pipettieren Sie mit einer 5-ml-Pipette etwa 5-10 Mal auf und ab. Schließen Sie den Deckel des Röhrchens und inkubieren Sie es 5 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad. Nach 5 Minuten die Zellen entnehmen und 5-10 Mal auf und ab pipettieren. Anschließend weitere 10-15 Minuten im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren.
- Bewegen Sie in den letzten 5 Minuten die Trypsin-Inhibitor-Lösung in die BSC.
- Entnehmen Sie die Zellen, nachdem Schritt 2.14 abgeschlossen ist, und pipettieren Sie die Zellen auf und ab, bis die Kugeln vollständig dissoziiert sind (20-30 Mal). Fügen Sie dann sofort die Trypsin-Inhibitor-Lösung hinzu und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab. Diese Lösung aus dissoziierten Zellen und Trypsin-Inhibitor wird als "Zellsuspension" bezeichnet.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der Zellsuspension, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Pipettieren Sie 15 μl Trypanblau-Vormischung (bestehend aus 5 μl 0,4 % Trypanblau und 10 μl dPBS) auf ein kleines Wägeschiffchen und fügen Sie dann 5 μl der Zellsuspension hinzu. Pipettieren Sie zum Mischen 3-5 Mal auf und ab. Pipettieren Sie dann 10 μl der Trypanblau/Zellsuspension auf eine der beiden Seiten eines Hämozytometers, das mit einem Glasdeckglas bedeckt ist.
- Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jedem der vier Eckgitter. Addieren Sie diese Zahlen.
- Wiederholen Sie die Zählung für die andere Seite und mitteln Sie beide Seiten zusammen.
- Multiplizieren Sie diese Zahl mit 10.000, um die Gesamtzahl der Zellen pro ml zu erhalten. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Gesamtzahl der Milliliter, um die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension zu berechnen. Berechnen Sie, wie viel Volumen der Zellsuspension benötigt wird, um 5 Millionen Zellen pro T75-Kolben zu säen.
Anmerkung: In der Regel hat ein T75 nach 9-10 Tagen 25-30 × 106 Zellen. Wenn also alle Zellen in neue Kolben umgefüllt werden, werden insgesamt 5-6 Kolben benötigt.
- Das in Schritt 3.19 berechnete Volumen der Zellsuspension wird in jeden T75-Kolben gegeben, um 5 × 106 Zellen pro Kolben zu erhalten. Wenn das Volumen weniger als 5 ml beträgt, fügen Sie zusätzliches Bedingungsmedium hinzu, um insgesamt 5 ml zu erhalten. Geben Sie dann 10 ml neues DFHGFPS-Medium mit Wachstumsfaktoren (Tabelle 1) in den Kolben.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.17 und 1.18 und stellen Sie sicher, dass der Kolben mit dem Zelltyp, dem Datum, der Anzahl der Zellen im Kolben und der Durchgangsnummer (dies ist die Anzahl der Passagen, die die Zelle durchlaufen wurde) beschriftet ist. Fahren Sie dann mit Schritt 4 fort.
- Falls erforderlich, werden zusätzliche Zellen über Nacht in einen T75-Kolben mit einer Dichte von bis zu 30 × 106 Zellen pro Kolben ausgesät und am nächsten Tag gemäß Schritt 4 eingefroren.
>4. hNSC Einfrieren und Lagern
- Am Tag nach der Passage wird der Kolben aus dem Inkubator entnommen, in dem sich die Zellen zum Einfrieren befinden (aus den Schritten 3.19 und 3.22). Kippen Sie den Kolben, nehmen Sie das gesamte Medium und die Zellen aus dem Kolben und geben Sie ihn in ein 15-ml-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 216 x g für 5 min.
- Während des Zentrifugationsprozesses wird das Gefriermedium vorbereitet (Tabelle 4). Bereiten Sie für jeweils 5 × 106 Zellen 1 ml Gefriermedium vor. Die Anzahl der Zellen wurde in Schritt 3.19 bestimmt, als bestimmt wurde, wie viele Zellen in jeden Kolben gegeben werden sollten. Diese Nummer hat sich nicht über Nacht geändert.
- Bereiten Sie Kryo-Konservierungsfläschchen mit Etiketten mit Zellname, Durchgangsnummer, Zellnummer, Initialen und Datum vor. Nach der Zentrifugation wird der Überstand durch Aspiration entfernt und das Zellpellet in Gefriermedium wieder suspendiert, so dass 5 × 106 Zellen/ml vorhanden sind. Mit einer 5-ml-Pipette 1 ml pro Durchstechflasche aliquotieren und fest verschließen (5 × 106 Zellen pro Durchstechflasche).
- Stellen Sie die Fläschchen in einen Kryokonservierungsbehälter mit 250 ml Isopropanol (die maximale Verwendung beträgt 5 Mal pro Wechsel von Isopropanol). Über Nacht in einem -80 °C-Gefrierschrank lagern und dann in ein Flüssigstickstofftank-Lagersystem umfüllen.
>5. Plattierung von haftendem hNSC zur Validierung
- Reinigen Sie die BSC am Tag vor der Übergabe (Schritte 3.1-3.22) wie in Schritt 2.2 und besorgen Sie sich eine 24-Well-Platte und sterile 12-mm-Deckgläser aus Glas.
- Lege mit einer Pinzette ein einzelnes Deckglas auf den Boden jeder Vertiefung der Platte.
- Die Vertiefungsgläser mit Deckgläsern werden mit 0,01 % Poly-D-Lysin (PDL) in sterilem Wasser bestreicht und 1 h bei 37 °C inkubiert. Für eine 24-Well-Platte verwenden Sie 250 μl PDL pro Well.
- Entfernen Sie das PDL aus den Vertiefungen und beschichten Sie es dann mit 1 μg/cm2 Laminin/dPBS (250 μl pro Vertiefung). Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wenn Sie die Platte am nächsten Tag nicht benötigen, verschließen Sie sie mit Parafilm, indem Sie die Parafolie um die Ränder der Platte wickeln und bei 4 °C lagern.
Anmerkung: Mit Laminin beschichtete Platten können bis zu 2 Wochen gelagert werden, wenn sie mit Parafilm versiegelt sind, solange die Deckgläser nicht trocknen.
- Passagezellen wie in den Schritten 3.1 bis 3.22 beschrieben, und bestimmen Sie dann die Anzahl der Zellen, die in die 24-Well-Platte mit beschichteten Deckgläsern ausgesät werden sollen.
- Entfernen Sie überschüssige Lamininlösung durch Aspiration aus den Vertiefungen und spülen Sie sie einmal mit 0,5 ml dPBS aus. Dann säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 0,6-1 x 105 Zellen/cm 2 pro Vertiefung in die Vertiefungen. Verwenden Sie alle verbleibenden Zellen gemäß den Schritten 3.16-3.21.
- Fixieren und färben Sie die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der 24-Well-Plattenkultur für verschiedene Stammzellmarker.