Generierung von zerebralen Organoiden vom Vorderhirntyp aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Krefft, O. et al., Generierung von standardisierten und reproduzierbaren zerebralen Organoiden vom Vorderhirntyp aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video skizziert die Herstellung von Organoiden vom Vorderhirntyp aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) und demonstriert die Entwicklung von Stammzellaggregaten zu komplexen Strukturen, die die Hirnrinde nachahmen und sich in verschiedene Neuronentypen differenzieren.

Protokoll

>1. Erzeugung von iPSC-Aggregaten

1. Erzeugung von einzelligen Monolayer-Kulturen aus iPS-Kolonien
   1. Bereiten Sie eine mit Basalmembranextrakt (BME) beschichtete 6-Well-Platte vor. Tauen Sie BME auf dem Eis bei 4 °C für 2-3 h auf, verdünnen Sie es mit kaltem Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 Verdünnung), bedecken Sie die Platte mit 1 mL/Vertiefung der verdünnten BME-Lösung und lagern Sie die Platte über Nacht bei 4 °C.
   2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie intakte iPSC-Kolonien von mindestens zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte zweimal mit 0,5 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), be....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nr. A83-01	StemGent	Tel.: 130-106-274	500 nM
B27 Beilage	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044	1 bis 100
Basalmembran-Extrakt (z.B. Geltrex)	Gibco	Nr. A14132-02
Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP)	Sigma-Aldrich	Nr. A9501	0,15 μg/ml
Reagenz für Zelldissoziation (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Zählkammer z.B. Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glukose	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg/ml
DMEM-F12 L-Glutamin	Gibco	11320033
Einbetten von Formen (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	Artikel-Nr.: 4565
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	Nr. E6511	0,5 mM
Gelantin	Sigma-Aldrich	Nr. G1890
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 μg/ml
Inhibitor der WNT-Reaktion (IWR-1)	Enzo Biowissenschaften	BML-WN103-0005	10 μg/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C	2,5 μg/ml
L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMax)	Gibco	35050038	1 %
6 cm Platten mit geringer Haftung	Labomedic (Englisch)	Artikel-Nr.: 2081646L
10 cm Platten mit geringer Haftung	Labomedic (Englisch)	Artikel-Nr.: 2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-104-171	180 nM
N2 Ergänzung	Gibco	Artikel-Nr.: 17502-048	1 bis 200
Nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140035	0,50 %
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Nr. P6148	4,00 %
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190144
Paraffinfolie aus Kunststoff (Parafilm)	BRAND GMBH + CO KG	701606
ROCK-Inhibitor Y-27632	Zellführungssysteme	SM02-100	5 μM oder 50 μM
Saccharose	Sigma-Aldrich	Nr. S7903
Röhrchen 15 mL	Corning Biowissenschaften	Tel.: 734-0451
Objektträger z.B. Superfrost Plus Objektträger	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 4951PLUS4
6-Well-Platte für Gewebekulturen	Falke	Tel.: 734-0019
24-Well-Platte für Gewebekulturen	Falke	Tel.: 734-0949
Trypanblaue Beize	Gibco	Tel.: 15250-061
Extrem niedrig bindende 96-Well-Lipidur-Coat-Platte A-U96	Amsbio	AMS.51011610