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>1. Erzeugung von iPSC-Aggregaten
- Erzeugung von einzelligen Monolayer-Kulturen aus iPS-Kolonien
- Bereiten Sie eine mit Basalmembranextrakt (BME) beschichtete 6-Well-Platte vor. Tauen Sie BME auf dem Eis bei 4 °C für 2-3 h auf, verdünnen Sie es mit kaltem Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 Verdünnung), bedecken Sie die Platte mit 1 mL/Vertiefung der verdünnten BME-Lösung und lagern Sie die Platte über Nacht bei 4 °C.
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie intakte iPSC-Kolonien von mindestens zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte zweimal mit 0,5 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bevor Sie Kolonien mit 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS für 4 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Aspirieren Sie die EDTA-Lösung und lösen Sie die Kolonien vorsichtig, indem Sie sie mit 5 ml DMEM-F12-Medium vom Boden der Schale abwaschen. Sammeln Sie sie in einem 15-ml-Röhrchen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation (4 min bei 1.200 x g bei RT).
HINWEIS: iPSCs, die aus kommerziell erhältlichen Fibroblasten reprogrammiert wurden, wurden erfolgreich eingesetzt.
- Der Überstand wird aspiriert und die iPS-Kolonien werden 6 Minuten lang bei 37 °C mit 500 μl Zelldissoziationsreagenz inkubiert.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals vorsichtig mit einer 1 mL-Pipette auf und ab, um die restlichen Zellcluster in einzelne Zellen aufzuteilen.
- Geben Sie 4 ml DMEM-F12 in die Zellsuspension, um das Zelldissoziationsreagenz zu verdünnen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 1.200 x g für 4 min bei RT herunter.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL iPSC-Medium, ergänzt mit 5 μM Y-27632, und säen Sie die Zellen in eine Vertiefung einer BME-beschichteten 6-Well-Platte.
Anmerkung: Verwenden Sie das in der Materialtabelle angegebene iPSC-Medium für einzellige Monolayer-iPSC-Kulturen.
- Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches iPSC-Medium, dem Y-27632 fehlt. Von diesem Zeitpunkt an kultivieren Sie die Zellen weiter und wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die iPS-Zellen zu 100 % konfluent sind. Abhängig von der Zelllinie und dem Zusammenfluss der Startwells dauert dies zwischen 2-4 Tagen.
- Sobald sie zusammenfließen, passieren Sie die iPSCs. Aspirieren Sie das Medium und tragen Sie 500 μl Zelldissoziationsreagenz auf die Zellen auf.
- Inkubieren Sie die Zellen 5-10 Minuten lang bei 37 °C. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu lösen.
- Waschen Sie die Zellen aus der Vertiefung mit 2 mL DMEM-F12 und sammeln Sie sie in einem 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie DMEM-F12 für ein Gesamtvolumen von 5 ml hinzu.
- Schleudern Sie die Zellen bei 1.200 x g für 4 min bei RT herunter und aspirieren Sie den Überstand.
- Aussaat der Zellen in iPSC-Medium, ergänzt mit 5 μM Y-27632 im Verhältnis 1:2 bis 1:4 auf einer BME-beschichteten 6-Well-Platte (2 mL/Well des Mediums).
- Kultivieren Sie die Zellen 2-5 Tage lang und wechseln Sie täglich das iPSC-Medium, dem Y-27632 fehlt. Sobald sie zusammenfließen, passieren Sie iPSCs (Schritte 1.1.4-1.1.8).
Anmerkung: Die iPSCs werden für mindestens 2 Passagen als Monoschicht in dem in der Materialtabelle angegebenen iPSC-Medium kultiviert, bevor sie zur Erzeugung von iPSC-Aggregaten verwendet werden, damit sich die Zellen an die Kulturbedingungen anpassen können.
- Verwenden Sie Monolayer-iPSC-Kulturen, wenn sie zu 70-90 % konfluent sind, für die Erzeugung von iPSC-Aggregaten.
HINWEIS: iPSC ist an die Kulturbedingungen angepasst, da einzelne Zellen weniger anfällig für Stress sind, der während des Dissoziations- und Aggregationsverfahrens zum Zelltod führt. Monolayer-iPSC-Kulturen müssen eine typische pluripotente Morphologie ohne Hinweise auf eine Differenzierung aufweisen. Testen Sie die Kulturen regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination. Arbeiten Sie nur mit mykoplasmenfreien iPSC-Kulturen.
- Aspirieren Sie das Kulturmedium aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte und tragen Sie 500 μl Zelldissoziationsreagenz auf die Zellen auf.
- Inkubieren Sie die Zellen 5-10 Minuten lang bei 37 °C. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu lösen.
- Waschen Sie die Zellen aus der Vertiefung mit 2 mL DMEM-F12 und sammeln Sie sie in einem 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie DMEM-F12 für ein Gesamtvolumen von 10 ml hinzu.
- Für die Zellzählung nehmen Sie 25 μl aus der Zellsuspension und mischen sie mit 25 μl Trypanblau, um tote Zellen zu markieren. Zählen Sie die lebenden Zellen mit Hilfe einer Zählkammer.
- Sammeln Sie genügend Zellen (4.500 Zellen pro iPSC-Aggregat) aus der Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 1.200 x g für 4 min bei RT herunter und aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen iPSC-Medium, das mit 50 μM Y-27632 ergänzt wird, um 4.500 lebende Zellen pro 150 μl zu erhalten< br />
Anmerkung: Die Verwendung einer hohen Konzentration von Y-27632 (50 μM) ist entscheidend für das Überleben der iPSCs.
- 150 μl in jede Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte mit niedrigem Aufsatz geben und bei 37 °C und 5 % CO2,
in den Inkubator legen
Anmerkung: Bei der Erzeugung von iPS-Aggregaten ist zu berücksichtigen, dass an Tag 20 mindestens 6 Organoide für die Qualitätskontrolle benötigt werden (siehe Abschnitt 5).
>2. Induktion des anterioren Neuroektoderms
- Überwachen Sie die morphologischen Veränderungen der iPSC-Aggregate jeden Tag unter dem Gewebekulturmikroskop mit einer 4- oder 10-fachen Vergrößerungslinse. Beobachten Sie an Tag 1 Zellaggregate mit klaren Rändern. Kultivieren Sie weiterhin iPSC-Aggregate im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2,
Anmerkung: Eine bestimmte Anzahl abgestorbener Zellen/Vertiefung ist normal und hat keinen Einfluss auf die Organoidbildung.
- Füttern Sie die iPSC-Aggregate ab Tag 2 und fahren Sie mit jedem zweiten Tag fort, indem Sie etwa 2/3 des Mediums sanft ansaugen, ohne die Zellaggregate am Boden zu stören. Fügen Sie weitere 100 μl iPSC-Medium hinzu, dem Y-27632.
Anmerkung: Innerhalb von 4-6 Tagen haben die Zellaggregate einen Durchmesser von 350-450 μm und weisen glatte Kanten auf.
- In diesem Stadium werden die Zellaggregate mit einer abgeschnittenen 100-μl-Pipettenspitze in eine 6-cm-Schale mit geringer Bindung (maximal 20 Aggregate/Schale) in kortikalem Induktionsmedium gepoolt, das DMEM-F12 mit N2-Supplement (1:200), B27-Supplement (1:100), Glucose (0,2 mg/ml), cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP; 0,15 μg/ml), 0,5 % nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) enthält. 1% L-Alanyl-L-Glutamin, Heparin (10 μg/ml) und die Verbindungen LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) und Inhibitor der Wnt-Response-1 (IWR-1) (10 μg/ml). Füttern Sie die Zellaggregate, indem Sie das kortikale Induktionsmedium 3 Tage nach dem Transfer in die 6-cm-Schale wechseln.
- Überwachen Sie morphologische Veränderungen während der kortikalen Induktion unter dem Gewebekulturmikroskop mit einer 4-fachen Power-Linse.
Anmerkung: Nach 4-5 Tagen in kortikalem Induktionsmedium sollten die Ränder der Zellaggregate an der Oberfläche aufzuhellen beginnen, was auf eine neuroektodermale Differenzierung hinweist. In diesem Stadium entsteht die radiale Organisation eines pseudostratifizierten Epithels. Fahren Sie mit Abschnitt 3 fort, um die Zellaggregate in eine BME-Matrix einzubetten.
>3. Einbettung von neuroektodermalen Aggregaten in ein Matrixgerüst
- BME auf Eis bei 4 °C für 2-3 h auftauen. Unverdünntes BME in ausreichender Menge aliquotieren.
- Bereiten Sie eine Paraffinfolienplatte aus Kunststoff für den Einbettungsvorgang vor. Schneiden Sie die Kunststoff-Paraffinfolie mit einer sterilen Schere in 4 cm x 4 cm große Stücke, legen Sie ein Stück der Kunststoff-Paraffinfolie auf eine leere 100 μL Spitzenschale für 100 μL Spitzen und drücken Sie mit einem behandschuhten Finger so, dass kleine Grübchen in der Kunststoff-Paraffinfolienplatte entstehen (1 Grübchen/Zellaggregat erforderlich). Reinigen Sie die Kunststoffparaffinfolie mit 70% Ethanol und bestrahlen Sie sie unter der geschlossenen Sterilbank für 30 min mit UV-Licht (Leistung: 15 Watt, Wellenlänge: 435 nm).
- Übertragen Sie jedes Zellaggregat mit einer 100-μl-Schnittspitze mit einer Öffnung von 1,5 bis 2 mm Durchmesser auf ein Grübchen der Paraffinfolienplatte. Für den Fall, dass zwei Zellaggregate verschmolzen sind, trennen Sie sie nicht, sondern übertragen Sie sie zusammen auf ein Grübchen.
- Das Medium, das die Zellaggregate umgibt, wird mit einer ungeschnittenen 100-μl-Pipettenspitze vorsichtig abgesaugt.
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Zellaggregate nicht in die Spitze zu saugen, da dies die Aggregate beschädigt.
- Geben Sie 40 μl unverdünntes BME zu jedem Zellaggregat
.
- Positionieren Sie jedes Zellaggregat mit einer ungeschnittenen 100-μl-Pipettenspitze in der Mitte des BME-Tropfens.
Anmerkung: Seien Sie sehr vorsichtig, um das sich entwickelnde Neuroepithel nicht mit der Pipettenspitze zu beschädigen.
- Übertragen Sie die Paraffinfolienplatte vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in eine 10 cm Petrischale (oder eine andere ausreichend geeignete Zellkulturschale) und stellen Sie die Schale für 15-20 Minuten in den Inkubator, damit sich der BME verfestigen kann.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine 6-cm-Schale mit niedrigem Aufsatz vor, die 5 ml kortikales Induktionsmedium enthält.
- Entfernen Sie nach der Polymerisation von BME die Tröpfchen, die die Zellaggregate enthalten, von der Paraffinfolienfolie aus Kunststoff. Drehen Sie die Paraffinfolie aus Kunststoff mit einer sterilen Pinzette um und drücken Sie die Zellaggregate vorsichtig in die leicht geneigte (ca. 30°) 6 cm Schale mit niedrigem Anhang, bis die Tröpfchen von der Paraffinfolienplatte aus Kunststoff fallen. Füllen Sie maximal 16 Zellaggregate in eine 6 cm große Schale.
- Inkubieren Sie die Zellaggregate weiter bei 37 °C.
>4. Erzeugung von Organoiden vom Vorderhirntyp aus neuroektodermalen Aggregaten
- Einen Tag nach dem Einbetten in eine BME-Matrix stellen Sie die Organoid-Kulturschalen auf einen wippenden Zellkulturschüttler mit einem Kippwinkel von 5° und 14 U/min, der in einem Zellkultur-Inkubator installiert ist.
- Überwachen Sie Organoide jeden Tag. Nach der Einbettung in die BME-Matrix entwickeln sich nach und nach homogene neuroepitheliale schleifenartige Strukturen.
- Wenn neuroepitheliale Schleifenstrukturen sichtbar sind, wechseln Sie das Medium zu einem organoiden Differenzierungsmedium, das DMEM-F12 mit N2-Supplement (1:200), B27-Supplement (1:100), Glucose (0,2 mg/ml), cAMP (0,15 μg/ml), 0,5 % NEAA, 1 % L-Alanyl-L-Glutamin, Insulin (2,5 μg/ml)
enthält
- Tauschen Sie das Organoid-Differenzierungsmedium alle 3-4 Tage aus, bis der gewünschte Differenzierungszeitpunkt erreicht ist. Fixieren Sie dann die Organoide (siehe Abschnitt 5).
Anmerkung: Gelegentlich kann das Gewebe Knospen aus optisch durchscheinendem Gewebe ohne Schlingenstrukturen aufweisen. Dies ist zwar nicht ideal, hat aber keinen Einfluss auf die Entwicklung der kortikalen Strukturen. Die Organoide können bis zu 40 Tage in Organoid-Differenzierungsmedium kultiviert werden. Für längere Kulturzeiträume (40-100 Tage) kann das organoide Differenzierungsmedium mit 1:50 BME ergänzt werden, um die Gewebekomplexität zu erhöhen, und mit BDNF und GDNF, um das Überleben und die Reifung der Neuronen zu ermöglichen.