Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir, wie in der Herstellung und Nutzung mikrofabrizierten post-Array-Detektoren (mPADs) zu Modulationen der zellulären Kontraktilität beurteilen.

Zusammenfassung

In diesem Video präsentieren wir unseren Ansatz zur zellulären Zugkräfte über eine mikrostrukturierte Reihe von Stellen zu messen. Zugkräfte werden durch Myosin-Aktin-Interaktionen generiert und spielen eine wichtige Rolle in unserer Physiologie. Während der Entwicklung, ermöglichen sie Zellen von einem Ort zum nächsten bewegen, um den frühen Strukturen der Gewebe zu bilden. Zugkräfte Hilfe im Heilungsprozess. Sie sind notwendig für die ordnungsgemäße Schließung von Wunden oder die Migration von Leukozyten und kriechen durch unseren Körper. Dieselben Kräfte kann sich nachteilig auf unsere Gesundheit im Fall von Krebs Metastasen oder vaskuläre Wachstum hin zu einem Tumor. Die häufigste Methode, mit der Zellen in vitro zu untersuchen wurde ein Glas-oder Polystyrol-Schale verwenden. Allerdings macht die Steifigkeit der Substrate es unmöglich, körperlich messen Zelle Zugkräfte, und es gibt relativ wenige Methoden, um Zugkräfte zu studieren. Unser Labor hat eine Technik, um diese Einschränkungen zu überwinden entwickelt. Die Methode basiert auf einer vertikalen Anordnung von flexiblen Auslegern, die Steifheit und Größe zu skalieren, von denen so dass die einzelnen Zellen über viele Ausleger verteilen und lenken sie in den Prozess beruhen. Die Säulen wir benutzen, sind 3 mu m im Durchmesser, 10 mm hoch und werden in einer regelmäßigen Anordnung mit 9 um Mitte-zu-Zentrum-Abstand konfiguriert. Aber diese physischen Abmessungen können leicht variiert werden, um eine Vielzahl von Studien aufnehmen. Wir beginnen mit einem Silizium-Master, aber die endgültige Beiträge sind aus Silikon-Kautschuk genannt Poly (dimethylsiloxan) oder PDMS hergestellt. Wir können die Verformungen unter dem Mikroskop zu messen und berechnen Sie die Größe und Richtung der Zugkräfte erforderlich, um die beobachteten Ablenkungen zu erzeugen. Wir nennen diese Substrate mikrofabrizierten post-Array-Detektoren oder mPADs. Hier zeigen wir Ihnen, wie wir und fertigen die mPADs zu Modulationen der zellulären Kontraktilität beurteilen.

Protokoll

Silicon-Master Mold Fabrication

Lithographie

Materialien:

• 75 mm Silizium-Wafer
• SU-8 2 Negative Photoresist (Microchem, Boston, MA)
• N2

Methode:

1. Entwässern Si-Wafer bei 120 ° C für 2 Stunden.
2. UV Ozon zu behandeln Oberfläche für 7 Minuten zu entfernen organische Stoffe.
3. N2 Schlag Oberfläche zu entfernen Partikel.
4. Bewerben SU-8 2 bis 70% der Fläche (~ 10 ml für 75 mm-Wafer) zu decken.
5. Spin bei 2000 rpm für 20 Sekunden mit 300 rpm / s Beschleunigung.
6. Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 95 ° C.
7. Softbake der Fotolack für 15 Minuten bei 95 ° C.
8. Flood aussetzen Wafer für 20 bis 25 mJ/cm2 Dosis bei 365 nm (I-Linie), um die untere Schicht bilden.
9. Bewerben SU-8 2 für die zweite Photoresistschicht.
10. Spin bei 550 rpm für 20 Sekunden mit 300 rpm / s Beschleunigung für eine ca. 11 mu m Dicke Film.
11. Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 65 ° C.
12. Softbake der Wafer bei 65 ° C für 5 Minuten.
13. Ramp der Heizplatte von 65 ° C bis 95 ° C.
14. Softbake der Wafer für 55 Minuten bei 95 ° C.
15. Coole Wafer auf Raumtemperatur für 20 Minuten.
16. Richten Sie mpad Maske auf den Wafer und setzen für 95 bis 100 mJ/cm2 Dosis bei 365 nm (I-Linie).
17. Legen Sie die Wafer auf einer Heizplatte und Rampe von Raumtemperatur bis 95 ° C.
18. Post-Exposure Bake der Fotolack 25 Minuten bei 95 ° C.

Entwickeln

Materialien:

• 100mm Glasschalen (5)
• Propylenglykolmethylether (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Methode:

1. In einer chemischen Kapuze, füllen fünf Gerichte mit PGMEA (2), IPA und Hexan (2).
2. Halten Sie Wafer in der 1. PGMEA für 10 Sekunden
3. Agitieren Wafer für 50 Sekunden
4. Transfer-Wafer bis zum 2. PGMEA mit Meniskus PGMEA.
5. Agitieren für 5 Sekunden.
6. Transfer-Wafer zu IPA mit Meniskus PGMEA.
7. Man schüttelt 20 Sekunden lang.
8. Transfer-Wafer bis zum 1. IPA.
9. Agitieren für 5 Sekunden.
10. Transfer-Wafer bis zum 2. IPA.
11. Agitieren für 5 Sekunden.
12. Schnelles Entfernen Wafer vom 2. IPA mit Meniskus IPA und trocken mit N2
13. Untersuchen Muster.
14. Hardbake Wafer bei 120 ° C für 14-20 Stunden, um Cross-Link-SU-8.
15. Dice des Wafers mit einem Diamantschneider
16. Montieren Sie die Wafer auf einem Glasträger mit Epoxy
17. Fluorosilanize der Wafer (siehe Anleitung bei der Replikation Moulding)

Replication Formen von mPADS

Negativform

Materialien:

• Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Boot
• Polydimethylsiloxan (PDMS) base & Härter (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silane: (Tridecafluor-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-Trichlorsilan
• Glasträger
• Glas Pasteur Pipette

Methode:

1. Mix PDMS 10:1 durch Gewicht und Degas in unter Vakuum 1 Stunde, um Luftblasen zu entfernen.
2. Legen Silizium Master-Form in Aluminium Boot.
3. Gießen Sie 50 bis 60 g PDMS über Master-Form in Aluminium Boot.
4. Degas unter Vakuum für 30 Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
5. Blow off der Oberfläche eingeschlossene Luftblasen in PDMS mit schnellen Explosion von N2.
6. Legen Boot in Umluftofen bei 110 ° C für 15 Minuten, bis PDMS ist fest.
7. Cut entfernt Aluminium-Boot.
8. Mit Rasierklinge, wegschneiden PDMS unter Silizium-Master.
9. Peel PDMS weg vom Silizium-Master langsam und mit konstanter Bewegung in eine Richtung zu vermeiden, die Zerstörung der Meister.
10. Überprüfen Silizium-Master für Schäden.
11. Cut Negativform in 4 Stücke.
12. Wiederholen Sie die Schritte 1-10 für einen großen Stapel von Negativformen.
13. Sauerstoff-Plasma behandelt Negativform für 1,5 Minuten an die Oberfläche zu aktivieren, oder
14. Ozon behandeln Negativform für 10 Minuten an die Oberfläche zu aktivieren.
15. Legen Sie Negativformen in Exsikkator mit mpad Funktionen ausgesetzt.
16. Verbreiten 250-500 ul von Silan auf Objektträger aus Glas in der Mitte der Exsikkator
17. Legen Glas Weide Pipette mit 150-200 ul von Silan in die Spitze innerhalb Exsikkator.
18. Vakuumkammer Silan und Mantel Negativformen für> 14 Stunden verdunsten.

mPADS

Materialien:

• Polydimethylsiloxan (PDMS) base & Härter (Dow, Midland, MI)
• Weithals-Einweg Transferpipetten
• 2 "x 3" Glasobjektträger
• Glass Scribe
• N2

Methode:

1. Mix PDMS 10:1 durch Gewicht und Degas in unter Vakuum 1 Stunde, um Luftblasen zu entfernen.
2. Spitzen silanisiert Negativformen in 'Kreuz'
3. Pipette PDMS in Negativformen so, dass die Funktionen sind vollständig zu einer 1mm Dicke bedeckt.
4. Warten Sie 30 Minuten für alle Luftblasen in der PDMS an die Oberfläche steigen.
5. In 30 'Ausfallzeiten, Staub 22x22mm (Nr. 2) Deckgläser mit einem Strom von N2.
6. Sauerstoff-Plasma behandelt Glasträger Hälften für 1,5 Minuten zu reinigen und zu aktivieren Glas
7. Blow off der Oberfläche eingeschlossene Luftblasen in PDMS mit schnellen Explosion von N2.
8. Sanft legte Rand des Deckglases auf PDMS mit Plasma gereinigt zugewandte Seite des PDMS. Langsam senken die Objektträger aus Glas, so dass die PDMS vollständig Kontakte der gesamten Glasoberfläche und vermeiden Sie Luftblasen immer unter dem Objektträger aus Glas gefangen.
9. Ort montiert Formen in Umluftofen bei 110 ° C für 20 Stunden, um vollständig zu heilen.
10. Entfernen Formen aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen auf RT.
11. Halten Glasträger mit einer Hand oben und ziehen Sie ihn langsam negativen weg die Negativform aus dem Boden, die mpad freizugeben.
12. Überprüfen Sie die mpad unter dem Mikroskop auf zusammengebrochen Beiträge.
13. Re-silanisieren Form über Plasma-und Silan alle vier Castings. Die Negativform Lebensdauer für gute Replikation beträgt ca. 6-20 wirft.

Seeding Cells auf mPADS

Stempeln

Materialien:

• PDMS-Stempel für UCP (siehe Tien, J & Chen, CS, in Methoden des Tissue Engineering, 2001, S. 113-120.)
• Ethanol (100% bzw. 70%)
• Sterilisiert deionisiertes Wasser
• 50 ug / ml humanem Fibronectin in sterilem, deionisiertem Wasser (BD Biosciences)
• 5 ug / ml DiI-Lösung mit 0,2 um Membran (D-3886, Molecular Probes, OR) gefiltert
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey)
• 1X Phosphatpufferlösung.
• 100 mm x 25 mm Petrischale (4)
• 150 mm x 25 mm Petrischale (2)
• Aluminiumfolie
• N2
• Pinzette
• Sterile Hood

Methode:

1. Schneiden Sie überschüssige PDMS von mPADs
2. Wenn die PDMS-Stempel hat bisher verwendet wurden, beschallen Briefmarken in 100% Ethanol für 5 Minuten zu schrubben entfernt kontaminierenden Proteinen.
3. In sterile Haube, halten Stempel auf ihren Seiten mit einer Pinzette und trocken mit N2 nach dem Eintauchen Briefmarken in frischen 100% Ethanol und steriles Wasser
4. Legen Sie in 150 mm Petrischale mit Arbeit nach oben.
5. Aliquot Tropfen Fibronektin-Lösung auf jeder Briefmarke. Beginnen Sie mit den Ecken auf jedem der Stempel, dann werden die Kanten und zuletzt die inneren Bereiche. Anfangs der PDMS-Oberfläche des Stempels ist hydrophob, hydrophil, sondern wird als das Protein adsorbiert wird. Working "von außen nach innen" ändert sich die Kontaktwinkel des PDMS, so dass ein geringeres Volumen von Fibronektin-Lösung vollständig zu beschichten der Stempel erforderlich ist.
6. Lassen Sie sitzen für 1 Stunde in der Motorhaube für Proteinadsorption.
7. Wash Briefmarken mit DI-Wasser durch Gießen in Schale und ließ den Wasserstand über die Marken steigen.
8. Wash Briefmarken in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser gefüllt.
9. Entfernen und trocken mit N2.
10. Ozon behandeln mPADS für 7 Minuten an der Oberfläche zum Stempeln zu aktivieren.
11. Unter der Motorhaube, Stempel mPADS indem Stempel Kante auf mpad und schonend senken die volle Kontakte zu knüpfen. Leicht auf der Oberseite des Stempels mit einer Pinzette, um sicherzustellen, alle Bereiche haben einen guten Kontakt, aber vorsichtig sein, nicht zusammenbrechen den Pfosten.
12. Entfernen Sie vorsichtig Stempel mit einer Pinzette.
13. Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit 100% Ethanol für ~ 15 Sekunden. Keep Mikronadeln von Entnetzung während der Übertragung durch die Übertragung schnell zwischen Gerichten.
14. Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit 70% Ethanol für ~ 15 Sekunden.
15. Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden.
16. Tauchen mPADS im zweiten 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden.
17. Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit DI-Wasser.
18. Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit 100 ml DiI-Lösung.
19. Mit Alufolie abdecken und für 1 Stunde einweichen.
20. Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden.
21. Tauchen mPADS in 150 mm Petrischale mit 10 ml 2% Pluronics und 90 ml PBS für die gesamte Konzentration von 0,2% Pluronics.
22. Cover und genießen für 1 Stunde.
23. Tauchen mPADS in 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden.
24. Tauchen mPADS im zweiten 100 mm Petrischale mit DI-Wasser für ca. 15 Sekunden.
25. Tauchen mPADS im dritten 100 mm Petrischale mit PBS für ~ 15 Sekunden.

Seeding

Materialien:

• Chosen-Zelllinie
• Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin mit EDTA • 4NA, Gibco Cat. Nr. 25200-056)
• Wachstumsmedium
• 1X Phosphatpufferlösung.

Methode:

1. In sterile Haube Platz mPADS in 100 mm Petrischale mit 17 ml Medium zu füllen.
2. Legen Sie Petrischale in Inkubator auf 37 ° C erwärmen
3. Suspend-Zellen über Trypsin
4. Saugen Sie mehrmals, um aufzubrechen Zellhaufen.
5. Pipet Zellsuspension in die Petrischale mit dem mPADS. Hinzufügen von Zellen, wie sie einzelne Zellen (ohne Zell-Zell-Kontakte) zum Zeitpunkt der Analyse bleiben. Die genaue Höhe der Zellen, um hinzuzufügen, ist Zelltyp-spezifisch undhängt Zelle ausbreiten Bereich und Wachstumsrate.
6. Vorsichtig verteilen Zellen in Petrischalen mit langsamen pipettieren.
7. Legen Sie in Inkubator für 2 Stunden, damit Zellen, sich niederzulassen und auf Mikronadeln halten.
8. Überprüfen Sie mPADS zu sehen, ob Zellen ausgebreitet haben. Die Zellen aussehen wird abgeflacht und span sechs oder mehr Stellen.
9. Wenn Zellen verteilt sind, übertragen mPADS neue 100 mm-Petrischale mit 21 ml frisches Medium.
10. Die mPADS sind bereit für das Experiment.

Beizen und Montage mPADS

Festsetzung

Materialien:

• Entionisiertes Wasser
• Paraformeldahyde (16%) Fläschchen
• 10X Phosphatpufferlösung.
• 1X Phosphatpufferlösung.

Methode:

1. In einem 50 mL Zentrifugenröhrchen, 30 ml DI, 10 ml paraformeldahyde (ganze Flasche) und 4,5 ml 10X PBS für die Fixierlösung.
2. Add ~ 25 ml Fixierlösung zu einer 100 mm Petrischale.
3. Sanft tauchen mit Zellen in Befestigung Gericht mpad und lassen inkubieren für 20 Minuten.
4. Tauchen mPADS in 100 mm-Schale mit 1X PBS dreimal.
5. Ready for Immunfärbung und Montage.

Analyse zellulärer Kräfte auf mPADS

Konfokale Bildgebung

Materialien:

• Konfokalmikroskop
• 63X Ziel
• Filter Würfel für Sekundärantikörper
• Grünfilter cube (Rhodamin) für DiI Bildgebung von Mikronadeln.

Methode:

1. Legen Sie mPADs auf der Bühne und finden Einzelzellen mit 300 ms Belichtung, keine Binning.
2. Bild Spitzen der Mikronadeln für TOP BILD.
3. Mit z-control-Anzeige, Aufnahme Bild von Mikronadeln für untere Bild.
4. Bild jedes andere Kanäle haben Sie Flecken in (Hoechst, Phalloidin etc.)

Image Analysis

Materialien:

• MATLAB mit Image Processing Toolbox

Methode:

1. Drehen und registrieren Sie oben und unten Bilder
2. Messen Schwerpunkte der Unterseite (abgelenkten) und oben (abgelenkt) Positionen
3. Berechnen Sie die Verschiebung
4. Mit der Federkonstante für die Beiträge (auch bekannt, hängt von post-Geometrie), berechnen Kraftvektor bei jedem Beitrag
5. Fehler Analyse basiert auf der Fähigkeit, Kräfte zu lösen basiert, und ist abhängig von der Bildauflösung und Schwerpunkt-Erkennung Auflösung
6. Ordnen Sie die Daten gemäß Ihrer individuellen Bedürfnisse - zB Kraftgrößen und / oder Richtung, als eine Zeit natürlich viele Messungen über unterschiedliche Bedingungen etc.