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>1. Vorbereitung von Materialien, die für die iPSC-Kultur und die BEC-Differenzierung benötigt werden.
- Matrixbeschichtung aus Gewebekultur-Kunststoff (TC) für IMR90-4 iPSC-Kultur
- Aliquotes Basalmembran-Matrix-Gel (z. B. Matrigel) in 2,5 mg Aliquots und Lagerung bei -20 °C.
Anmerkung: Arbeiten Sie schnell mit dem Matrixgel und aliquotieren Sie es auf Eis, da es oberhalb von 4 °C ein Gel bildet und nach dem Erstarren nicht mehr aliquotiert werden kann.
- Für die Beschichtung von TC-Kunststoff geben Sie schnell ein Aliquot Matrixgel zu 30 mL Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 Medium von Dulbecco in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 1 ml des Mediums auf das gefrorene Matrixgel, pipettieren Sie es auf und ab, bis es aufgetaut ist, und geben Sie es sofort mit dem restlichen Medium in das konische 50-ml-Röhrchen.
- Verwenden Sie 1 ml dieser Matrix-Gel-Beschichtungslösung pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und 12 ml pro T75-Kolben.
Anmerkung: Matrix-Gel-beschichteter TC-Kunststoff kann bis zu zwei Wochen vor seiner Verwendung aufbereitet werden. Es ist jedoch wichtig zu vermeiden, dass die Matrixgellösung austrocknet, was die gelegentliche Zugabe von mehr DMEM/F12 auf die Vertiefungen erfordern kann.
- Bereiten Sie das Stammzellerhaltungsmedium vor, indem Sie 50 ml 50x Zusatz zu 450 ml Stammzellerhaltungs-Basalmedium in der sterilen Umgebung einer Biosicherheitswerkbank hinzufügen.
- Um 500 ml unkonditioniertes Medium (UM) herzustellen, kombinieren Sie 392,5 ml DMEM/F12 mit 100 ml Knock-out-Serumersatz (KOSR), 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin in einer Endkonzentration von 1 mM und 3,5 μl β-Mercaptoethanol. Filtersterilisieren und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
- Zur Herstellung von 200 ml Endothelzellmedium (EC) plus Retinsäure (RA) plus bFGF kombinieren Sie 198 ml humanes endotheliales Serummedium (hESFM), 2 ml filtersterilisiertes Thrombozytenarmes abgeleitetes Serum (PDS) und 20 ng/ml bFGF. Filtrieren, sterilisieren und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern. Kurz vor der Zugabe zu den Zellen werden 10 μM RA in das EC-Medium gegeben.
Anmerkung: Da die PDS abgesetzt wurde und daher möglicherweise eingeschränkt ist, wurde dieses Protokoll erfolgreich mit B27 anstelle von PDS durchgeführt.
- Zur Herstellung von 200 mL EC-Medium ohne RA oder bFGF werden 198 mL hESFM und 2 mL filtersterilisiertes PDS kombiniert und mit Filter sterilisiert. Bis zu 4 Wochen bei 4 °C lagern.
2. Differenzierung von Endothelzellen des Gehirns von menschlichen iPSCs
- Plattierung von iPSCs zur Differenzierung (Tag -3 des Differenzierungsprotokolls)
- Pro IMR90-4-Erhaltungskultur-Well, das zur Differenzierung verwendet wird, aspirieren Sie das Kulturmedium, fügen Sie 1 ml enzymatisches Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 7 Minuten lang bei 37 °C.
- Inaktivieren Sie das enzymatische Zelldissoziationsreagenz, indem Sie das 1 ml dissoziierte Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit mindestens 2 ml frischem Stammzellerhaltungsmedium pro 1 ml Zellen überführen. Die Zellsuspension bei 1.500 x g 5 min einschleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Stammzellerhaltungsmedium pro Well der verwendeten IMR90-4-Zellen und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Anmerkung: Es kann hilfreich sein, 1:1 mit 0,4% Trypanblau zu verdünnen, um bei der Zählung zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Abhängig von der Dichte der iPSCs ergibt eine Vertiefung einer 6-Well-Platte in der Regel 1 bis 106 Zellen.
- Zur Differenzierung in einem T75-Kolben werden 7,5 x 105 Zellen in 12 ml Stammzellerhaltungsmedium und ROCK-Inhibitor (Y27632-Dihydrochlorid) in einer Endkonzentration von 10 μM gegeben. Die Matrix-Gel-Beschichtungslösung aus einem T75-Kolben aspirieren und die Zellsuspension in den Kolben überführen. Die Zellen werden gleichmäßig verteilt, indem der Kolben hin und her und von links nach rechts geschüttelt wird, und bei 37 °C und 5 % CO2,
Anmerkung: Es ist wichtig, in diesem Schritt einen ROCK-Inhibitor hinzuzufügen, um das Überleben der dissoziierten Einzelstammzellen zu verbessern. Die Zellen sollten gleichmäßig über den Kolben und in Einzellingen verteilt werden, die aufgrund der Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor eine gespreizte, mesenchymale Morphologie aufweisen.
- An Tag -2 und Tag -1 wird das Medium auf frisches Stammzellerhaltungsmedium umgestellt; 12 ml pro T75.
- Beginnen Sie an Tag 0 mit der Differenzierung, indem Sie das Medium auf UM (12 mL pro T75) umstellen.
- Ändern Sie UM täglich (Tag 1 – Tag 5).
Anmerkung: Die Zellen erreichen in der Regel nach 2 bis 3 Tagen in UM die Konfluenz, die mit bloßem Auge oder durch ein inverses Hellfeldmikroskop beobachtet werden kann. Mit fortschreitender Differenzierung werden nestin+ "Nervenbahnen" sichtbar, dazwischen liegen PECAM-1+ Zellen.
- Selektive Erweiterung der Endothelzellpopulation durch Umstellung auf EC-Medium mit 20 ng/mL bFGF und 10 μM Retinsäure (RA) (Tag 6) und zweitägige Inkubation. EC-Medium mit bFGF kann bis zu zwei Wochen vorher hergestellt werden. RA wird am Tag der Anwendung aus gefrorener Brühe zugegeben (z. B. 1 μl 10 mM RA-Brühe pro 1 mL EC + bFGF).
Anmerkung: Eine erfolgreiche Differenzierung kann auch ohne Supplementierung der RA an den Tagen 6 und 8 erreicht werden. Das Weglassen von RA führt jedoch zu BECs mit reduziertem TEER.
Beschichten Sie - Zellkulturplatten und Membraneinsätze (z. B. Transwell) mit Kollagen IV und Fibronektin (Tag 7) für die Aufreinigung der BECs und die anschließenden Experimente.
- Kombinieren Sie für die Beschichtung von Membraneinsätzen 4 Teile Kollagen IV (1 mg/ml in 0,5 mg/ml Essigsäure), 1 Teil Fibronektin (1 mg/ml) und 5 Teile steriles Wasser in Gewebequalität. Die ECM-Lösung kann 1:5 verdünnt werden, um Zellkulturplatten zu beschichten (d. h. 4 Teile Kollagen IV, 1 Teil Fibronektin, 45 Teile Wasser). Über Nacht mit einer Beschichtungslösung bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Platten und Membraneinsätze können auch mindestens 4 h vor der Subkultivierung am selben Tag des Reinigungsschritts beschichtet werden.
- Reinigen Sie BECs, indem Sie die differenzierten Zellen auf Kollagen-IV- und Fibronektin-beschichteten Platten oder Membraneinsätzen subkultivieren (Tag 8).
- EC-Medium aspirieren und enzymatisches Zelldissoziationsreagenz (12 mL pro T75) hinzufügen. Bei 37 °C inkubieren, bis sich 90 % der Zellen vom Kolben gelöst haben.
Anmerkung: Die Zelldissoziation kann bis zu 1 h dauern.
- Während der Inkubationszeit die Kollagen-IV/Fibronektin-Beschichtungslösung von zuvor vorbereiteten Platten/Einsätzen entfernen und in einer sterilen Haube trocknen lassen. Es dauert ca. 20 Minuten, bis die Einsätze getrocknet sind.
- Sobald sich die Zellen abgelöst haben, waschen Sie sie mit einer 10-ml-Pipette aus dem Kolben. Pipettieren Sie auf und ab, um eine Einzelzellensuspension zu erhalten.
Anmerkung: Die Einzelzellsuspension ist wichtig für eine zuverlässige Zellzählung und um feste Monoschichten zu erzielen.
- Mit mindestens dem gleichen Volumen frischer hESFM in einem konischen 50-ml-Röhrchen verdünnen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 x g für 10 min.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von frisch zubereitetem EC + bFGF + RA, um eine Suspension von 2 x 106 Zellen/ml für die Aussaat auf Membraneinsätzen zu erhalten. Geben Sie 500 μl (1 x 106 Zellen) auf einen 12-Well-Einsatz und 1,5 ml EC + bFGF + RA-Medium auf die Unterseite. Für die Aussaat auf 24- und 48-Well-Platten verdünnen Sie die Zellsuspension 1:2 und fügen Sie 500 μl (5 x 105 Zellen) bzw. 250 μl (2,5 x 105 Zellen) pro Well hinzu. Die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung/den Einsatz verteilen und bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.
- Wechsel des Mediums auf Platten/Transwells auf EC ohne bFGF oder RA (Tag 9).