Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF)
Sammeln Sie das periaortale Bogenfettgewebe (PAAT) von 5-6 Mäusen in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml frisch zubereitetes Verdauungsmedium enthält, und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Schere in einem Eppendorf-Röhrchen bei Raumtemperatur (RT).
- Die Mischung wird in 50-ml-Röhrchen mit 9 ml des Aufschlussmediums umgefüllt. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie mit einer 1-ml-Pipette 10x auf und ab pipettieren.
- Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 100 U/min für 30–45 Minuten und überprüfen Sie sie alle 5–10 Minuten, um eine Überverdauung zu vermeiden. Dies ist entscheidend für die Verbesserung der Zellviabilität und -ausbeute.
Anmerkung: Eine gute Gewebeverdauung führt zu einem homogenen, hellgelben Fettgewebe, das beim sanften Schwenken der Röhre mit bloßem Auge sichtbar ist.
- Stoppen Sie den Aufschluss, indem Sie 5 ml HDMEM mit 10 % FBS und 1 % v/v PS bei RT hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei RT. Das SVF ist als bräunliches Pellet sichtbar. Die schwimmenden Adipozyten vorsichtig aspirieren und den restlichen Überstand dekantieren, ohne die SVF zu stören. Das SVF-Pellet in 10 mL Kulturmedium auflösen und durch ein 70 μm Zellsieb filtrieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 500 x g, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer in einem konischen 15-ml-Röhrchen für 10 Minuten bei RT.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml 1x PBS mit 1% FBS hinzufügen. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 4 °C bei 500 x g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet in 10 ml 1x PBS mit 1 % FBS resuspendiert.
- Die Zellen werden erneut bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet in 5 mL Kulturmedium in einem konischen 15-ml-Röhrchen bei 4 °C resuspendiert.
- Nach einer abschließenden Zentrifugationsrunde (500 x g für 5 min bei 4 °C) resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 5 mL FACS-Puffer (PBS enthält 10 % FBS, 100 Einheiten/ml DNA I und 1 % v/v PS) auf Eis und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
>2. Isolierung von NCADSCs durch FACS
- Einrichten und Optimieren des Zellsortierers gemäß der Bedienungsanleitung. Wählen Sie die 100-μm-Düse aus, sterilisieren Sie die Sammelröhrchen, installieren Sie die gewünschte Auffangvorrichtung und richten Sie die Nebenströme ein.
- Für die Sortierung von RFP+-Zellen werden ein 561 nm Gelb/Grün-Laser und der optische Filter 579/16 empfohlen. Die Kompensation ist mit der Negativkontrolle und der einfach gefärbten Positivkontrolle durchzuführen. In Abbildung 1A finden Sie das Gating-Schema.
- Die Zellen werden durch ein 40-μm-Sieb filtriert, 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert und in 2 ml FACS-Puffer bei einer Dichte von 0,5–1 x 107/ml resuspendiert. Füllen Sie die Zellen in deutlich beschriftete 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und laden Sie sie in den Sortierer.
- Lassen Sie das experimentelle Probenröhrchen bei 4 °C laufen, schalten Sie die Ablenkplatten ein und sortieren Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit RPMI vorbeschichtet ist und 1 % v/v PS.
Anmerkung: Schützen Sie die Proben vor starkem Licht, um RFP-Quenching zu minimieren.
>3. Kultur der NCADSCs
- Die sortierten Zellen werden mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm2 in einer 12-Well-Kulturplatte in vollständigem Kulturmedium plattiert und bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 20–24 h inkubiert.
- Entfernen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS (37 °C), um Zellreste zu entfernen, und fügen Sie frisches Kulturmedium hinzu.
