Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Herstellung von sterilen Poly-D-Lysin (PDL) und Lamininlösungen
- Mindestens einen Tag vor der Zellisolierung Poly-D-Lysin (PDL) und mit Laminin beschichtete Platten vorbereiten.
Anmerkung: Abhängig von den experimentellen Zielen wurden sowohl 6-Well- als auch 12-Well-Platten hergestellt. Typischerweise wurden 12-Well-Platten für die quantitative Analyse mit Western Blots verwendet, während 6-Well-Platten zur Aufnahme von autoklavierten (sterilen) Deckgläsern für die Immunhistochemie verwendet wurden. 24-Well-Platten wurden verwendet, um enterische Gliazellen (EGCs) für die Ca2+-Flussbildgebung zu kultivieren.
- Verdünnen Sie Stammlösungen mit hochreinem Wasser in Gewebekulturqualität, DNase- und RNase-freiem Wasser in einer Gewebekulturhaube mit HEPA-gefilterter Luft.
- Sterilisieren von Glasdeckgläsern
- Halten Sie das Deckglas mit einer sterilen Pinzette fest und tauchen Sie die Deckgläser 15 Minuten lang in ein Becherglas mit 100 % Ethanol. Lassen Sie das Ethanol in der Gewebekulturhaube verdampfen und geben Sie es dann in die 6-Well-Platten.
- Alternativ können Sie mehrere Deckgläser einzeln auf 2 mm dickes Löschpapier in einen Kunststoffbehälter legen und anschließend autoklavieren.
>2. Beschichtungsplatten
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte unter einer Laminar-Flow-Haube mit steriler Gewebekultur durch.
- Tauen Sie 1 mg/ml PDL-Stamm auf und verdünnen Sie es 1:10 mit sterilem Wasser in Gewebekulturqualität, so dass die Endkonzentration 100 μg/ml beträgt. Verwenden Sie 2 ml pro Vertiefung, um 6-Well-Platten zu beschichten, 1 ml, um eine Vertiefung einer 12-Well-Platte abzudecken, und 0,5 ml für eine Vertiefung in den 24-Well-Platten. Lagern Sie das restliche verdünnte PDL in 12-ml-Aliquoten bei -20 °C.
- Nachdem Sie die Vertiefungen mindestens 1 h lang von der PDL beschichten ließen, entfernen Sie die PDL mit einer sterilen Pipette. Lassen Sie die Platten unter einer Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur vollständig an der Luft trocknen.
Anmerkung: Nach der Entnahme der PDL-Lösung mit einer sterilen Pipette kann sie nach dem Passieren eines 0,22 μm Filters und der Lagerung bei 4 °C innerhalb von 1 Woche noch zweimal verwendet werden.
- Tauen Sie die Lamininbrühe auf Eis auf, um Gelbildung zu vermeiden.
Anmerkung: Unverdünntes Laminin wird fest, wenn es über 8 °C erwärmt wird.
- Verdünnen Sie die Lamininbrühe (0,5 mg/ml) 1:50 mit steriler Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um eine Endkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Lagern Sie das verdünnte Laminin in 12 mL Aliquots bei -20 °C.
- Geben Sie verdünntes Laminin in die Vertiefungen, die getrocknetes PDL enthalten. Verwenden Sie 1 ml, um die 6-Well-Oberfläche abzudecken, und 0,5 mL, um den Boden der 12-Well-Platten zu bedecken. Bei Deckgläsern fügen Sie den Deckgläsern 400 μl verdünntes Laminin hinzu, um eine Oberflächenabdeckung zu erreichen.
- Inkubieren Sie die beschichteten Platten bei 37 °C für 2 h, wenn die Platte am selben Tag verwendet wird (Schnellbeschichtung). Wenn nicht, verschließen Sie die Platten mit Frischhaltefolie und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C (langsame Beschichtung).
Anmerkung: Die Abdichtung ist entscheidend, um Austrocknung und Kontamination zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Lamininlösung vorsichtig mit einer Pipette, um Kratzer auf der Oberfläche zu vermeiden. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal vorsichtig mit sterilem DPBS.
- Geben Sie in jede Vertiefung das vollständige Gliawachstumsmedium und halten Sie die Platten bei 37 °C, bis die EGC-Suspension hinzugefügt werden kann.
Anmerkung: Mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtete Platten können 3 Tage bei 4 °C gelagert werden. Beschichten Sie die Platten mehrere Tage im Voraus und lagern Sie sie dann bei 4 °C. Waschen Sie die Platten dreimal mit steriler Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS). Geben Sie nach der letzten Wäsche 2 ml steriles DPBS in jede Vertiefung. Die Platte mit Parafilm verschließen und bei 4 °C lagern. Es ist unbedingt darauf zu achten, dass das Laminin nicht austrocknet.
>3. Herstellung von Isolationslösungen
- Bereiten Sie die EDTA/HEPES/DPBS-Dissoziationslösung vor. Verwenden Sie für 500 mL der Lösung steriles DPBS (ohne Kalzium und Magnesium), um eine endgültige Lösung von 10 mM HEPES und 5 mM EDTA herzustellen. Zu 490 mL des DPBS 5 mL 1 M HEPES-Puffer und 5 mL 0,5 M EDTA-Stammlösung hinzufügen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie das Gliazell-Resuspensionsmedium mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien vor.
- Bereiten Sie gliale Wachstumsmedien mit den in Tabelle 2.<br /> aufgeführten Reagenzien vor
Anmerkung: Gliawachstumsmedien, die GDNF enthalten, können eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
>4. Entfernung des Darmsegments
HINWEIS: Mäusen wurde vor der Euthanasie durch die Isofluran-Drop-Methode und die Entnahme eines lebenswichtigen Organs freier Zugang zu Nahrung und Wasser gewährt. C57BL/6 Mäuse, die älter als 8 Wochen waren, wurden verwendet. Es wurden beide Geschlechter verwendet, ohne dass es zu nennenswerten Unterschieden in der Zubereitung kam.
- Euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran und legen Sie sie in Rückenlage in eine Präparierschale. Stecke die Extremitäten fest und sterilisiere den Bauch mit 70% Ethanol. Zelten Sie die Haut mit einer Pinzette und öffnen Sie dann den Bauch mit einer Schere.
- Heben Sie die Leber an und identifizieren Sie den distalen Magen/Pylorus. Entfernen Sie dann 7 cm des proximalen Darms. Achte darauf, dass du den Darm nicht zerreißt.
- Halten Sie den Pylorus mit einer Pinzette fest, während Sie das Mesenterium abschneiden.
- Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion mit der Rückseite der Schere, um die anhaftende Bauchspeicheldrüse abzukratzen.
- Legen Sie den Darmabschnitt in eiskaltes DPBS ohne Ca2+ oder Mg2+ (Abbildung 1A).
Anmerkung: Auch andere Segmente des Darms oder des Dickdarms können mit der gleichen Technik entfernt werden.
- Verwenden Sie eine 5- oder 10-ml-Spritze, die an einer 20-G-Nadel mit stumpfem Ende befestigt ist, um den Stuhlinhalt mit eiskaltem DPBS auszuspülen (Abbildung 1B).
- Teilen Sie den Darm in 3 cm große Segmente, um den Längsmuskel zu entfernen. HINWEIS: Darmsegmente von bis zu zwei Mäusen werden pro 30 ml der HEPES/EDTA/DPBS-Isolationslösung verwendet.
- Brechen Sie ca. 4 cm ab, um das Holzstäbchen von der Wattespitze zu trennen. Weichen Sie den Holzstab in DPBS ein (Abbildung 1C).
- Schieben Sie eines der Darmsegmente glatt auf das benetzte Stäbchen (Abbildung 2A-C).
- Entfernen Sie das anhaftende Mesenterium, das noch mit einer Spitzzange befestigt ist (Abbildung 2D).
- Verwenden Sie eine saubere Rasierklinge oder ein Skalpell, um zwei Längsschnitte entlang des Darms zu machen, an der das Mesenterium befestigt war (Abbildung 2E).
- Befeuchten Sie das Wattestäbchen mit DPBS. Reiben Sie die benetzte Wattespitze in Längsrichtung entlang des Muskels, um den Längsmuskel/Myenterusplexus (LMMP) zu lockern. Bewegen Sie dann das Wattestäbchen horizontal, um das LMMP während der LMMP-Entfernung entlang der Länge des Darmsegments vom kreisförmigen Muskel zu entfernen.
- Halten Sie die Spitze des Sticks zwischen Daumen und Zeigefinger, während Sie das Segment mit dem Mittelfinger und dem vierten Finger stabilisieren (Abbildung 2F). Wenn der LMMP abgeschlossen ist, löst er sich leicht vom Darmsegment.
- Entsorgen Sie das aus dem Darmschlauch entnommene und an das Wattestäbchen gebundene LMMP, es sei denn, die Entnahme von EGCs aus dem Plexus myentericus ist erwünscht.
- Mit einer Rasierklinge das Darmsegment in Längsrichtung aufschäumen, um es vom Holzstäbchen zu entfernen.
- Lagern Sie das abgestreifte Darmgewebe (überwiegend Schleimhaut und Submukosa plus Zirkularmuskulatur) in DPBS auf Eis. Wiederholen Sie die Schritte 4.4–4.11, bis alle Darmsegmente vorbereitet sind.
>5. Entfernung der Epithelschleimhaut
- Den Darm mit einer feinen Schere in kleinere Stücke von ~0,5 cm schneiden.
- Legen Sie das Gewebe in ein steriles konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 mL eiskalter EDTA/HEPES/DPBS-Lösung.
- Schütteln Sie die gewebehaltige Lösung bei 4 °C für 10 min bei ~60 Neigungen pro Minute.
- Befeuchten Sie eine 5-ml-Kunststoffpipette vor, indem Sie den EDTA/HEPES/DPBS-Puffer einmal auf und ab pipettieren und dann mit der vorbefeuchteten Pipette das Gewebe und die Puffersuspension 20 Mal auf und ab pipettieren (Verreibung), um die Epithelschleimhaut zu entfernen.
- Sammeln Sie das Gewebe aus der EDTA-Inkubation, indem Sie die Mischung durch ein 100-μm-Nylon-Zellsieb gießen. Entsorgen Sie den trüben, mit Schleim gefüllten Durchfluss (Abbildung 3).
- Legen Sie das im Sieb zurückgehaltene Gewebe mit einer Nadelzange in ein neues konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 mL eiskaltem EDTA/HEPES/DPBS.
- Wiederholen Sie die EDTA/HEPES/DPBS-Inkubation ein zweites Mal, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei 4 °C bei ~60 Neigungen pro Minute schaukeln, um zusätzliche Epithelschleimhaut zu entfernen.
- Befeuchten Sie eine 5-ml-Pipette mit dem Puffer und pipettieren Sie dann die Gewebesuspension 20 Mal auf und ab, um die Schleimzellen zu entfernen.
Anmerkung: Das Gewebe neigt dazu, an der Innenseite der Pipette zu kleben, wenn mehr Epithel entfernt wird.
- Sammeln Sie das Gewebe nach der zweiten Inkubation, indem Sie die Mischung durch ein 100-μm-Nylon-Zellsieb gießen und den Durchfluss verwerfen. Der zweite Durchfluss sollte deutlich weniger trüb sein als der erste (Abbildung 3).
- Wiederholen Sie die 10-minütigen EDTA-Inkubationen, bis die Lösung nahezu klar ist (etwa 3 bis 4 Inkubationen, abhängig von der Gewebemenge und der Wirksamkeit der Verreibung) (Abbildung 3).
>6. Entnahme enterischer Gliazellen aus der Lamina propria und Submucosa
- Übertragen Sie das Gewebe aus dem Nylonsieb in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 5 mL der handelsüblichen Zellrückgewinnungslösung und Gestein für 25–30 Minuten bei 4 °C enthält.
- Triturieren Sie sanft 10x, um die enterischen Gliazellen von der Lamina propria zu dissoziieren.
- Filtrieren Sie durch einen 40 μm Filter und sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50 mL Röhrchen.
- Spülen Sie das Tuch auf dem Nylonfilter mit 1 ml DPBS ab.
- Entsorgen Sie das Gewebe und geben Sie die ~5–6 ml Filtrat in ein sauberes konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Das Filtrat bei 2.000 x g in einer Schwingeimerzentrifuge für 5 min bei 4 °C schleudern.
- Suspendieren Sie das Gliazellen-haltige Pellet in mindestens 1 ml Resuspensionspuffer, indem Sie das Pellet vorsichtig mit einer 500-μl-Pipettenspitze auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Einführung von Blasen.
Anmerkung: Passen Sie das Resuspensionsvolumen nach Bedarf für die Anzahl der Vertiefungen und Platten an. Beispiel: 1,2 mL für eine 6-Well-Platte, 2,4 mL für zwei 6-Well-Platten, 2,4 mL für eine 12-Well-Platte.
- Pipettieren Sie 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der 6-Vertiefung oder 100 μl für eine 12-Well-PDL-Laminin-beschichtete Platte, die gliale Wachstumsmedien enthält.
- Stören Sie die Schalen nicht, nachdem Sie die Zellen auf die Platten gelegt und in den 37 °C heißen Inkubator gestellt haben, damit die maximale Anzahl der Zellen haften kann.
Anmerkung: Ein gesundes Präparat von Zellen bindet sich innerhalb von 6–8 Stunden, aber warten Sie mindestens 24 Stunden, bevor Sie das Medium wechseln, indem Sie das Medium vorsichtig zusammen mit nicht adhärenten Zellen abpipettieren.
- Verwenden Sie die Zellen 3–4 Tage nach dem Einbringen in Kultur für Experimente (Abbildung 4).
Tabelle 1. Zusammensetzung des Resuspensionsmediums für Gliazellen.
| Komponenten | Hinzuzufügendes Volumen | Endkonzentration |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 5 mL | 10 % |
| Penicillin-Streptomycin | 500 μL | 100 IE/ml Stift |
| Streptomycin | | 100 μg/ml Streptokokken |
| Gentamicin (50 mg/ml Stamm) | ca. 20 μl | 20 μg/ml |
Tabelle 2. Zusammensetzung von Wachstumsmedien für Gliazellen
| Komponenten | Hinzuzufügendes Volumen | Endkonzentration |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 5 mL | 10 % |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | 500μL | 100 I.E./ml (Stift) |
| 100 μg/ml (Streptometer) | | |
| Gentamicin (50 mg/ml Stamm) | ca. 20 μl | 20 μg/ml |
| GDNF (10 μg/mL Stamm) | 50 μL | 10 ng/ml |
