Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Reinigung von Schweinehirnkapillaren
- Sammle 8-10 Gehirne von 5-6 Monate alten Hausschweinen (z.B. von einem nahegelegenen Schlachthof) und transportiere sie auf Eis ins Labor. Wir empfehlen, das folgende Reinigungsverfahren innerhalb von 2-3 Stunden nach Beendigung des Tieres zu beginnen.
- Legen Sie die Gehirne in eine sterile Strömungsbank und waschen Sie sie vorsichtig mit 1 l PBS in einem auf Eis gestellten Becherglas.
- Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute aus jeweils einem Gehirn mit einer Pinzette mit feiner Spitze und übertragen Sie die hirnhautfreien Gehirne in ein anderes 1-Liter-Becherglas mit PBS, das auf Eis gelegt wird. Eine Verlängerung der benötigten Zeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit, die für jedes Gehirn verwendet wird, sollte 10-15 Minuten betragen.
- Kratzen Sie mit einem Skalpell die graue Substanz jeweils von einem Gehirn ab und geben Sie das isolierte Material in Petrischalen (8,8 cm2) mit 20 ml DMEM-Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F-12), die auf Eis gelegt werden. Isolieren Sie so viel graue Substanz wie möglich, ohne das Material der weißen Substanz zurückzuziehen. Für eine erste Fragmentierung führen Sie das Material der grauen Substanz ohne Nadel durch eine 50-ml-Spritze. Fahren Sie mit allen Gehirnen fort und sammeln Sie das gesammelte Material der grauen Substanz. Eine Verlängerung der benötigten Zeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit, die für jedes Gehirn verwendet wird, sollte 10-15 Minuten betragen.
- Übertragen Sie das isolierte Material der grauen Substanz in das Mahlröhrchen eines Hand-Tissue-Homogenisators im Verhältnis 50/50 mit DMEM/F-12-Medien. Homogenisieren Sie das Material, indem Sie 8 Auf- und Abbewegungen mit einem losen Stößel ausführen, gefolgt von 8 Auf- und Abbewegungen mit einem festen Stößel. Fahren Sie fort, bis das gesamte isolierte Material homogenisiert ist, dann übertragen Sie das Homogenat in eine 500-ml-Flasche und verdünnen Sie es mit DMEM/F-12 auf ein Gesamtvolumen von ca. 450 mL.
- Filtern Sie das Homogenat mit einer 500-ml-Flasche mit blauem Verschluss mit Filterhalter und 140-μm-Filternetz und isolieren Sie die Kapillaren, indem Sie das Gewebe durch den Filter führen. Verwenden Sie einen Filter pro 50 mL Homogenat und waschen Sie jeden Filter anschließend mit DMEM/F-12.
- Platzieren Sie die kapillarhaltigen Filter in Petrischalen mit einer Aufschlusslösung aus Trypsin/EDTA (2,5 % Trypsin, 0,1 nM EDTA in PBS), Kollagenase CLS2 (2.000 U/ml) und DNase 1 (3.400 U/ml) in DMEM/F-12. Verwenden Sie 1 Petrischale (8,8 cm2, 20 mL Lösung) pro 3 Filternetze.
- Stellen Sie die Petrischalen bei 37 °C für 1 h auf einen Orbitalschüttler bei 180 U/min oder rühren Sie sie alle 10 min vorsichtig um. Waschen Sie nach 1 h die Kapillaren von den Filtern mit Suspension aus der Petrischale mit einer 1-ml-Pipette ab.
- Teilen Sie die Suspension aus den 3 Schalen in 2 50-ml-Röhrchen auf und stoppen Sie den Aufschluss, indem Sie 10 mL DMEM/F-12 in jedes 50-ml-Röhrchen geben.
- Die Zellsuspensionen werden bei 250 x g, 4 °C für 5 min zentrifugiert. Die Überstände werden aspiriert und jedes Pellet in 10 mL DMEM/F-12 erneut suspendiert. Geben Sie weitere 20 mL DMEM/F12 in jedes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Zentrifugenschritt zweimal.
- Lassen Sie die Röhrchen 5 Minuten auf Eis abkühlen und geben Sie die Lösungen in 2 neue 50 mL Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 x g, 4 °C für 5 Minuten und resuspendieren Sie jedes Pellet in 8 - 10 mL (ca. 1 mL/Gehirn verwendet) Gefrierlösung, die aus 10 % DMSO in FBS besteht.
- Übertragen Sie die Zellsuspension mit 1 ml pro Kryoröhrchen auf Kryoröhrchen. Im Durchschnitt führt die Reinigung zu 1 Fläschchen pro verwendetem Gehirn, wobei im Durchschnitt Endothelzellen für 12-16 Inserts bereitgestellt werden. Stellen Sie die Fläschchen für mindestens 4 h bis über Nacht bei -80 °C in eine Gefrierbox. Lagern Sie anschließend die Kryofläschchen in einem Kryotank mit flüssigem Stickstoff.
Vorsicht: Flüssiger Stickstoff hat extrem niedrige Temperaturen. Bitte tragen Sie einen angemessenen Schutz.