Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Brzica, H., et al,. Eine einfache und reproduzierbare Methode zur Vorbereitung von Membranproben aus frisch isolierten Mikrogefäßen des Rattengehirns. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Gehirn-Mikrogefäßen von euthanasierten Ratten. Es umfasst die Dissektion des Gehirns, die Reinigung des Gewebes und die mechanische Verdauung, gefolgt von einer wiederholten Zentrifugation, um die reine Fraktion der Mikrogefäße zu isolieren.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt. Der Verfahrensablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

>1. Einrichtung für die Prozedur

1. Bereiten Sie den Mikrogefäßpuffer (BMB) des Gehirns vor. Beginnen Sie mit dem Wiegen von 54,66 g D-Mannitol, 1,90 g EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-TETRAESSIGSÄURE) UND 1,46 g 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (d. h. Tris) Base in ein sauberes Becherglas. Fügen Sie 1,0 l entionisiertes Wasser hinzu. Mischen Sie die Bestandteile des BMB-Puffers mit einem Magnetrührer. Nachdem die Lösung gründlich gemischt wurde, stellen Sie den pH-Wert mit 1,0 M HCl auf 7,4 ein.
2. Bereiten Sie eine 26%ige Dextranlösung (MW 75.000) (w/v) vor, bevor Sie die Tiere betäuben. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die Dextranlösung vorzubereiten.
   Anmerkung: Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Lösung im Voraus vorzubereiten, da es etwa 1,5 bis 2 Stunden dauern kann, bis sich Dextran in einem wässrigen Puffer aufgelöst hat.
   1. Das pulverisierte Dextran (26 g pro 100 ml Puffer) wird in ein sauberes Becherglas gewogen.
   2. Messen Sie das entsprechende Volumen BMB ab und geben Sie es in ein separates, sauberes Becherglas.
   3. Gießen Sie BMB langsam in das Becherglas mit dem Dextranpulver. Während des Aufgießens von BMB das pulverförmige Dextran mit einem Glasrührstab manuell mischen.
   4. Stellen Sie den pH-Wert unmittelbar vor der Verwendung auf 7,4 mit 1,0 M HCl ein.
      Anmerkung: Eine typische Isolierung von Hirnmikrogefäßen von 12 einzelnen Sprague-Dawley-Ratten (männlich oder weiblich; im Alter von 3 Monaten; jeweils 200-250 g) erfordert 200 ml Dextranlösung (d. h. 52 g Dextran in 200 ml BMB).

>2. Extraktion von Hirngewebe aus Sprague-Dawley-Ratten

1. Nach der gewünschten experimentellen Behandlung anästhesieren Sie Sprague-Dawley-Ratten mit Ketamin (50 mg/kg; 2,5 ml/kg i.p.) und Xylazin (10 mg/ml; 2,5 mL/kg i.p.). Verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in 0,9 % Kochsalzlösung auf Endkonzentrationen von 20 mg/ml bzw. 4,0 mg/ml. Tiere durch Enthauptung mit einer geschärften Guillotine gemäß den Richtlinien des IACUC (Institutional Animal Care & Use Committee) einschläfern. Wenden Sie das gleiche Verfahren für männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten an.
2. Trennen Sie die Haut vom Rattenschädel, indem Sie mit einer chirurgischen Schere einen einzigen Querschnitt machen.
3. Entfernen Sie mit Rongeur vorsichtig die Schädelplatte und legen Sie das Gehirn frei.
4. Entferne das Gehirn mit einem Spatel. Entfernen Sie das Großhirn und geben Sie das isolierte Hirngewebe in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 5 mL BMB enthält. Unmittelbar vor der Anwendung 1,0 μl Proteaseinhibitor-Cocktail pro 1,0 ml BMB-Puffer hinzufügen.

>3. Verarbeitung des Gehirns

1. Übertragen Sie das Hirngewebe aus dem konischen 50-ml-Röhrchen in eine saubere Petrischale.
2. Rollen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig auf Filterpapier mit einem Durchmesser von 12,5 cm, um die äußeren Hirnhäute zu entfernen, die lose an der Großhirnrinde haften. Drücken Sie das Gehirngewebe vorsichtig gegen das Filterpapier und rollen Sie das Taschentuch erneut auf. Drehen Sie das Filterpapier während dieses Schritts häufig.
3. Trennen Sie den Plexus choroideus mit einer Pinzette von den Gehirnhälften.
   Anmerkung: Der Plexus choroideus erscheint als klares membranöses Gewebe, das an der Oberfläche der Hirnventrikel lokalisiert ist.
4. Glätten Sie das Hirngewebe sanft und entfernen Sie die restlichen Hirnhäute und Riechkolben mit einer Pinzette.
5. Legen Sie das kortikale Hirngewebe in einen gekühlten Glasmörser. Geben Sie 5,0 ml BMB-haltigen Proteasehemmer-Cocktail in den Mörser.
6. Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit einem Überkopf-Leistungshomogenisator mit 15 Auf- und Abbewegungen bei 3.700 U/min. Führen Sie die Homogenisierung mit einem 10-ml-Mörser und einer Stößelmühle durch. Zwischen der Homogenisierung jeder einzelnen Probe den Stößel mit 70 % Ethanol reinigen.
   Anmerkung: Die Homogenisierungshübe sollten in Bezug auf Tempo und Größe konsistent sein.
7. Gießen Sie das Homogenat in beschriftete Zentrifugenröhrchen.

>4. Zentrifugationsschritte

1. Geben Sie 8,0 ml 26%ige Dextranlösung in jedes markierte Zentrifugenröhrchen, das das Gehirnhomogenat enthält.
2. Drehen Sie das Röhrchen zweimal um und wirbeln Sie die Probe dann gründlich durch. Führen Sie das Vortexen jeder Probe aus mehreren Winkeln durch, um ein gründliches Mischen der Gehirnhomogenatlösung mit 26 % iger Dextranlösung zu gewährleisten.
3. Zentrifugieren Sie Proben bei 5.000 x g für 15 min bei 4 °C.
   Anmerkung: Für einige Analysen ist es nützlich, die Mikrogefäße des Gehirns mit dem Hirnparenchym zu vergleichen. Sollte die Beurteilung der Proteinexpression im Hirnparenchym erforderlich sein, kann der Überstand aus diesem Zentrifugationsschritt (d. h. die Hirnparenchymfraktion) entnommen und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
4. Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger und einer Pasteurpipette aus Glas.
   Anmerkung: Es ist darauf zu achten, dass das Pellet nicht gestört wird. Andernfalls wird die Menge der gesammelten Mikrogefäße des Gehirns reduziert, was die Proteinausbeute aus diesem Verfahren erheblich verringert.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in 5,0 ml BMB-haltigem Proteaseinhibitor-Cocktail (d. h. 1,0 μl Proteaseinhibitor-Cocktail pro 1,0 ml BMB-Puffer). Wirbeln Sie das Pellet vor, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
6. Geben Sie 8,0 ml 26 % Dextran in jedes Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es auf, wie in den Schritten 4.1 bis 4.2 dieses Protokolls beschrieben.
7. Zentrifugieren Sie Proben bei 5.000 x g für 15 min bei 4 °C.
8. Mit einem Isolierkolben und einer Glaspipette den Überstand absaugen und sicherstellen, dass das Pellet, das das Mikrogefäß des Gehirns enthält, nicht zerstört wird.
   Anmerkung: Überschüssiges Material, das an der Rohrwand haftet, enthält keine Mikrogefäße und sollte sorgfältig gereinigt und entfernt werden.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 bis 4.8 noch zwei weitere Male.
10. Sobald 4 Dextran-Zentrifugationsschritte abgeschlossen sind, fügen Sie 5,0 mL BMB zu jedem Pellet und Vortex hinzu, um die Probe wieder zu suspendieren.
    Anmerkung: Nach Abschluss von Schritt 4.10 können ganze Mikrogefäße für die Analyse der Proteinlokalisation entnommen werden. Dies kann erreicht werden, indem ein 50-μl-Aliquot aus resuspendiertem Mikrogefäßpellet entnommen und auf einen Glasobjektträger geschmiert wird. Anschließend werden die Mikrogefäße für 10 min bei 95 °C auf einem Heizblock hitzefixiert und anschließend für weitere 10 min in eiskaltem Ethanol fixiert. Die Objektträger können dann bei 4 °C gelagert werden, bis sie für bildgebende Untersuchungen benötigt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Skizzierung von Verfahren und Protokollen zur Isolierung von Mikrogefäßen des Rattengehirns und zur Aufbereitung von Membranproben

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease-Inhibitor-Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	#E3889	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
Trizma Basis	Sigma-Aldrich	#T1503	Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns
Dextran (75.000 MW)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran wird in Zentrifugationsschritten verwendet, um Mikrogefäße vom Hirnparenchym zu trennen
Zetamin	MWI Tiergesundheit	#501072	Vollnarkose
Xylazin	Westliche medizinische Versorgung	#5530	Vollnarkose
0,9% ige Kochsalzlösung	Westliche medizinische Versorgung	N/A	Vollnarkose-Verdünnungsmittel
Filterpapier (12,5 cm Durchmesser)	VWR	#28320-100	Wird zur Entfernung von Hirnhäuten aus dem Hirngewebe verwendet
Zentrifugen-Röhrchen	Sarstedt	#60.540.386	Einwegröhrchen für Dextran-Zentrifugationsschritte
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Messung der Proteinkonzentration in Membranpräparaten
Wheaton Overhead Power Homogenisator	DWK Lebenswissenschaften	#903475	Erforderlich für die Homogenisierung von Proben
10,0 ml Glasmörser und Stößelgewebeschleifer	DWK Lebenswissenschaften	#358039	Erforderlich für die Homogenisierung von Proben
Salzsäure	Sigma-Aldrich	#H1758	Erforderlich für die pH-Einstellung von Puffern
Standard-Pinzetten	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	#91100-12	Wird zur Dissektion von Hirngewebe verwendet
Friedman-Pearson Rongeurs	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	#16020-14	Wird zum Öffnen des Schädels verwendet, um das Gehirn zu isolieren
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	#352070	Wird zur Entnahme von Hirngewebe nach der Isolierung verwendet
Glaspasteur-Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Wird zur Aspiration von Zelltrümmern nach Dextrandrehungen verwendet
Ethanol, wasserfrei	Sigma-Aldrich	#459836	Wird zur Reinigung von Tissue-Schleifmaschinen verwendet; auf 70 % mit destilliertem Wasser verdünnt
Ketamin
Eiskübel