Generierung kortikaler Pyramidenneuronen aus humanen neuralen Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Gouder, L., et al,. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Herstellung von Glasdeckgläsern, die mit Polyornithin und Laminin beschichtet sind, um die Adhäsion und das Wachstum von neuralen Stammzellen zu verbessern. Die Technik beinhaltet sequentielle Inkubationen und Waschungen, die die Bildung einer unterstützenden Matrix erleichtern, die das Wachstum und die Differenzierung der neuronalen Zellen fördert und die in den Neuronen gefundenen Strukturen nachahmt.

Protokoll

1. Neuronale Kultur
   Anmerkung: Die Reprogrammierung von Fibroblasten in pluripotenten Stammzellen, die Bindung an die dorsale Telencephalon-Linie, die Ableitung, Amplifikation und Einlagerung von spätkortikalen Vorläuferzellen (LCP) wurden in Boissart et al. beschrieben. Die neuronale Differenzierung von LCP-ähnlichen Zellen wurde nach Boissart et al. mit leichten Modifikationen ebenfalls durchgeführt. Andere Verfahren wurden entwickelt, um Fibroblasten direkt in induzierte pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren und anschließend zu Neuronen zu differenzieren. Dieses Protokoll wurde beibehalten, da es die selektive Produktion von pyramidalen glutamatergen Neuronen ermöglicht.
   1. Behandeln Sie 6-Well-Kulturplatten mit Glasdeckgläsern mit Polyornithin (verdünnt auf 1/6 in DPBS (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline), Stammkonzentration 0,01 %) O/N, gefolgt von drei Waschgängen in DPBS. Geben Sie dann Laminin (Stammkonzentration 1 mg/ml, 500-fach in DPBS verdünnt) für mindestens 10 Stunden unter die Strömungshaube
   .
   2. NSC mit niedriger Dichte (50.000 Zellen/^cm2) in 6-Well-Kulturplatten mit Glasdeckgläsern in 3 ml Kulturmedium bestehend aus DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12 (500 ml), 2 Fläschchen (je 5 ml) N2-Supplement, 2 Fläschchen (je 10 ml) B27-Supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 Einheiten/ml und Streptomycin = 10.000 Einheiten/ml), 1 ml 2-Mercaptoethanol (Stammlösung: 50 mM) und Laminin (1/500), ohne Wachstumsfaktoren. KRITISCHER SCHRITT: Führen Sie diesen Schritt vorsichtig aus, indem Sie Zellen mit langsam rotierenden Bewegungen hinzufügen, um die Zellansammlung zu reduzieren.
   3. Entfernen Sie das Nährmedium. Fügen Sie frisches N2B27-Medium mit 2 μg/ml frischer Lamininlösung hinzu, um das Neuron an den Glasdeckgläsern zu halten und ein Verklumpen zu vermeiden. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Bewahren Sie einen Teil des restlichen Mediums (200 μl) auf, bevor Sie frisches Medium hinzufügen, um ein Austrocknen der Zelle zu verhindern. Alternativ können Sie schnell vorgehen und das Gesamtvolumen (3 ml) ändern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PD-PBS (1X), ohne Kalzium, Magnesium und Phenolrot	Gibco/ Life Technologies	14190169
Poly-L-Ornithin-Lösung Bioreagenz	Sigma Aldrich	Nr. P4957
Maus-Laminin	Dutscher Dominique	354232
N2 Ergänzung	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Supplement ohne Vit A (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/MUTTER. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-Mercaptoethanol	Gibco/ Life Technologies	Artikel-Nr.: 31350-010
Pen-Steptomycin	Gibco/ Life Technologies	Nr. 15140-122
Deckglas 13 mm	VWR	Tel.: 631-0150
Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPI	Gibco/ Life Technologies	Nr. P36931
Tween(R) 20 Bioextra, viskose Flüssigkeit	Sigma Aldrich Chimie	Nr. P7949
Humane Fibroblasten	Coriell Zelllinie Biorepository	GM 4603 und GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
CO2-Inkubator
6-Well-Kulturplatten
Piptette