Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung und Entnahme des Gehirns aus der Maus zum Schneiden
- Bereiten Sie die Perfusion und die Scheibeninkubation vor.
- Bereiten Sie ca. 30 Minuten vor dem Schneiden eine Schneidlösung mit hohem Saccharosegehalt und eine künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) mit niedrigem Kalziumgehalt für die Inkubation der Scheibe vor der Aufnahme oder Bildgebung vor.
- Legen Sie alle notwendigen Werkzeuge (große Schere mit stumpfem Ende, kleine Federschere, anatomische Pinzette, große Schere oder Guillotine, Irisschere, Juwelierzange, 10-ml-Spritze mit 27G x 1/2 Zoll Nadel, kleines Stück 1 cm x 2 cm Filterpapier und eine Pasteurpipette mit zerbrochener Spitze für den Scheibentransfer) für die Perfusion und das Schneiden bereit. und bereiten Sie die Perfusionsschale vor.
- Richten Sie die Inkubationskammer mit sauerstoffhaltigem aCSF in einem 32 °C Wasserbad und einer mit Schneidlösung gefüllten Kulturschale ein.
- Bereiten Sie die Schnittphase für das Schneiden vor.
- Schneiden Sie ein kleines Stück 3% Agar ca. 1 cm3 ab, um es als Rückhalt für das Gehirn zu verwenden, und 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm für eine Beule, die zur Abstützung des Colliculus inferior (IC) verwendet wird.
- Kleben Sie die Rücklaufsperre mit Cyanacrylatkleber sowie die Beule auf der rechten Seite der Rücklaufsperre so auf die Bühne, dass sie einen 80°-Winkel bilden.
- Entferne das Gehirn.
- Betäuben Sie eine Maus am 12. bis 20. postnatalen Tag (p12-p20, idealerweise p14-18) tief mit Ketamin 100 mg/kg und Xylaxin 3 mg/kg (oder einem vergleichbaren, von der Ethikkommission genehmigten Verfahren).
Anmerkung: Bestätigen Sie das richtige Anästhesieniveau durch mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen. Da das Tier kurz unter Narkose steht, ist eine Augensalbe nicht erforderlich.
- Legen Sie mit einer stumpfen Schere den Brustkorb vom Xiphoidfortsatz bis zum Hals frei.
- Finde den Xiphoid-Prozess und mache einen horizontalen Schnitt von ca. 1,5 cm.
- Machen Sie zwei vertikale Schnitte von den Enden des vorherigen horizontalen Schnitts bis zu den Schultern, jeweils ca. 1,5 cm.
- Schneiden Sie durch das Zwerchfell und die costochondralen Verbindungen, um das Herz freizulegen.
- Machen Sie mit einer kleinen Federschere einen kleinen Schnitt von 2-5 mm im rechten Vorhof, von der ventralen zur dorsalen Seite des Herzens.
- Injizieren Sie mit einer 10-ml-Spritze und einer 27G x 1/2 Zoll großen Nadel den linken Ventrikel und perfundieren Sie das Tier schnell mit Schneidlösung mit hohem Saccharosegehalt.
- Sobald das Blut klar ist, entfernen Sie den Kopf mit einer größeren Schere.
Anmerkung: Wir haben den Nutzen der Perfusion nicht systematisch bewertet. Unserer Erfahrung nach kann die transkardiale Perfusion bei so jungen Mäusen jedoch mit nahezu 100%igem Erfolg durchgeführt werden und hat den Vorteil, dass rote Blutkörperchen eliminiert werden, die fluoreszieren und die Bildgebung beeinträchtigen können.
- Schneide die Haut an der Mittellinie ab, um den Schädel freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer gebogenen Irisschere den Schädel zwischen den Augen und beginnen Sie dann mit dem Schnitt zwischen den Augen und schneiden Sie vorsichtig von vorne nach hinten entlang der Mittelliniennaht, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen.
Anmerkung: Die Dura löst sich in der Regel mit dem Schädel. Entfernen Sie gegebenenfalls die Dura, bevor Sie das Gehirn vorsichtig entfernen.
- Hebeln Sie mit einer Juwelierzange den Schädel auf, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn und legen Sie es dann in die Schneidlösung. Achten Sie darauf, die Kortikale nicht zu beschädigen.
>2. Vorbereiten des Gehirns für das Schneiden
- Vorbereitung des Gehirns für die Montage auf der Vibratomstufe.
- Entfernen Sie mit einem Objektträger, der mit zwei Linien bei 90° und einer diagonalen Linie bei 17° von links oben nach rechts unten markiert ist, die Stelle, an der sich die beiden Linien treffen, die Rückenseite des Gehirns nach oben, und entfernen Sie mit einer Rasierklinge 2-4 mm des rostralen Endhirns, so dass eine ebene Oberfläche entsteht.
- Platzieren Sie die kaudale Seite des Gehirns nach oben auf der neu geschaffenen flachen Fläche und richten Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns mit der Horizontalen und die Mittellinie des Gehirns mit der vertikalen Linie aus.
- Richten Sie die Rasierklinge auf die 17°-Linie aus, neigen Sie den Rasierer in einem Winkel von 30° und entfernen Sie ca. 3 mm der rechten Rinde in einem doppelten diagonalen Schnitt (17° aus der horizontalen Ebene und 60° aus der koronalen Ebene).
- Montage des Gehirns auf der Vibratombühne.
- Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier von 1 cm x 2 cm auf die ventrale Seite des Gehirns, so dass die lange Dimension senkrecht zur Mittellinie steht.
- Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge Cyanacrylatkleber auf den Bereich vor dem Backstop (und links von der Beule) auf.
- Legen Sie die doppelt diagonal geschnittene Hirnfläche so auf den Kleber, dass der kaudale Teil des Gehirns und des Hinterhirns auf der Beule aufliegt und die rechte Seite des Gehirns gegen den Rückhalt zeigt.
- Drücken Sie sanft auf das Gehirn und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche mit der Schnittkammer in Kontakt kommt.
>3. Gewinnung der kollikulo-thalamokortikalen Scheibe
- Nehmen Sie schnell die Schneidstufe und legen Sie sie in das Vibratom, füllen Sie die Bühne mit Schneidlösung.
- Richten Sie die Klinge an der Oberseite (ventrale Seite) des Gehirns aus.
- Entfernen Sie 1-1,5 mm von der Oberseite des Gehirns, entfernen Sie 300-500 μm große Scheiben und beurteilen Sie die Tiefe nach der Entfernung.
Hinweis: Wenn das IC, der mediale Genikulatkörper (MGB) und der Nucleus geniculatus lateralis (LGN) sichtbar sind und der Gyrus dentatus eine "C"-Form bildet, nehmen Sie ein bis zwei 600-μm-Schnitte auf. Siehe Abbildung 1A.
- Legen Sie die Scheiben in die beheizte (32 °C) Haltekammer.
