Methodenartikel

In-vitro-Induktion neuromuskulärer Verbindungen aus gentechnisch veränderten humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle:Lin, C. et al., In vitro Neuromuskuläre Verbindung, induziert aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. J. Vis.(2020).

Dieses Experiment beschreibt eine Methode zur Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen. Es verwendet einen stufenweisen Differenzierungsprozess, um die Entwicklung von Myotuben und Motoneuronen sowie die Synapsenbildung zu fördern, was zu funktionellen neuromuskulären Verbindungen führt.

Protokoll

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>1. Herstellung von mit extrazellulärer Matrix (ECM) beschichteten Platten

  1. Verdünnen Sie ECM (siehe Materialtabelle) mit eiskaltem 1x PBS auf eine Endkonzentration von 2%
  2. Fügen Sie 1 mL ECM zu 49 mL 1x PBS in einem 50 mL Kunststoffröhrchen hinzu. Gut mischen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
  3. Legen Sie 1 Deckglas in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Geben Sie 1,5 ml 2 % ECM in jede Vertiefung.
  4. Inkubieren Sie die Well-Platte mit 2 % ECM für 2 Stunden bei 37 °C.
  5. Aspirieren Sie ECM aus der Well-Platte und lagern Sie die Platte vor der Verwendung bei 4 °C.

2. Differenzierung von iPSCs in Richtung NMJ

  1. 4 x 105 iPS-Zellen pro Vertiefung auf der in Abschnitt 1 vorbereiteten 6-Well-Platte säen. Achten Sie darauf, die Zellen auf dem Deckglas, die Sie zuvor in der Vertiefung abgelegt haben, zu säen.
    Anmerkung: In dieser Studie wurde die 201B7MYOD iPS-Zelllinie verwendet.
    1. Entfernen Sie das Medium aus den iPSCs auf der 6 cm Kulturschale und waschen Sie die iPSCs einmal mit 1x PBS.
    2. 1 ml Zellablösungslösung in die Schale geben und 10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
    3. Geben Sie 3 ml Primaten-embryonales Stammzellmedium (ES) in die Schale und pipettieren Sie vorsichtig 3 Mal.
    4. Der Überstand, der abgelöste iPS-Zellen enthält, wird in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen gegeben und bei 160 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert.
    5. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig, resuspendieren Sie die iPSCs in 3 mL Primaten-ES-Zellmedium mit 10 μM Y27632 und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
    6. Verdünnen Sie die iPSCs mit Primaten-ES-Zellmedium und 10 μM Y27632 auf eine Konzentration von 2 x 105 Zellen/ml. Geben Sie 2 ml iPS-Zellen auf das Deckglas, das in der in Abschnitt 1 beschriebenen Vertiefung vordeponiert wurde.

>3. Induktion der iPSCs zu NMJ

  1. Entfernen Sie an Tag 1, 24 Stunden nach der Aussaat der iPS-Zellen auf die 6-Well-Platte, das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches Primaten-ES-Zellmedium mit 1 μg/ml Doxycyclin in jede Vertiefung
    2. .
  2. Wechseln Sie das Medium mit 2 ml myogenem Differenzierungsmedium (MDM) (Tabelle 1) mit 1 μg/ml Doxycyclin (Endkonzentration) in jede Vertiefung. Frischen Sie das Medium jeden Tag von Tag 2 bis Tag 10 auf.
  3. Schalten Sie ab Tag 11 das Medium auf 2 ml NMJ-Medium (Tabelle 1) in jede Vertiefung um. Aktualisieren Sie das Medium danach alle 3 bis 4 Tage bis zum 30. Tag.
  4. Beobachten Sie die differenzierte NMJ durch phaseninverse Mikroskopie an Tag 30. Der NMJ kann für die folgende Analyse verwendet werden.

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Ergebnisse

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Tabelle 1: Formel des Mediums.

Myogenes Differenzierungsmedium (MDM)MEM-alpha500 ml
100mM 2-ME1117μL
doxycyclin1μg/mL
Ksr56 ml (endgültig bis 10 %)
St...

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Medium, Wachstumsfaktoren und Reagenzien
2-MercaptoethanolNacalai tesqueArtikel-Nr.: 21418-42
B27, GibcoGibcoArtikel-Nr.: 12587-001
BDNFF & E-Systeme248-BD
Lösung zur Zellablösung, AccumaxSTEMCELL-Technologien#07921
Trockner für kritische PunkteHitachiES-2030
doxycyclinTakara631311
ECM, Matrigel (Wachstumsfaktor reduziert)CorningArtikel-Nr.: 356230
GDNFF & E-Systeme212-GD
Gelierung, IP-GelGeno MitarbeiterPG20-1
Ionen-BeschichterJEOLJEC3000FC
iPSC Medium, mTeSRSTEMCELL-TechnologienArtikel-Nr.: 85850
KnockOut SR (KSR)GibcoTel.: 10828-028
Mikroskopie von lebenden ZellenNikonEclipse Ti Mikroskop
MEM-alphaGibcoNr. 12571-071
N2, GibcoGibcoArtikel-Nr.: 17502-048
Neurobasales MediumGibcoArtikel-Nr.: 21103-049
NT3F & E-Systeme267-N3
Primaten ES ZellmediumReproCellRCHEMD001
SemHitachiNr. S-4700
TemHitachiNr. H7650
Nr. Y27632Wako Chemicals GmbHArtikel-Nr.: 253-00513

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Schlagwörter

Human iPSCsMYOD InductionMyotube FormationMotor Neuron DifferentiationNeuromuscular JunctionDoxycycline TreatmentROCK InhibitorECM CoatingCell DifferentiationSynapse Formation

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