Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Versuchsaufbau
- Überprüfen Sie vor Beginn der Gewebe- und Zellentnahme, ob alle Werkzeuge steril sind. Falls erforderlich, autoklavieren Sie eine scharfe chirurgische Schere, eine sehr feine Pinzette und eine feine Standardzange. Sterilisieren Sie außerdem gegebenenfalls jedes Substrat vor der Zellaussaat durch UV-Sterilisation, Ethanol-Belichtung oder Dampfsterilisation.
- Aufbereitung von Medien und Stammlösungen für die Neuronenernte und -dissoziation
- Bereiten Sie das Medium von Bottenstein und Sato (BS) vor, indem Sie dem F12-Medium von Ham 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) und 1 % N2-Supplement hinzufügen. Berechnen Sie das benötigte Endvolumen mit 500 μl pro Vertiefung (bei Verwendung einer 24-Well-Platte).
- Kollagenase IV-Brühen in Hams F12-Medium in einer Konzentration von 1,25 Gew.-% herstellen. Die Lösung filtrieren und bei -20 °C als 200 μl Aliquote lagern.
- Pankreastrypsin-Brühen vom Rinder in Ham's F12-Medium in einer Konzentration von 2,5 Gew.-% herstellen, filtrieren-sterilisieren und bei -20 °C als 200 μl Aliquote lagern.
- Die Stammlösung für den Nervenwachstumsfaktor (NGF) in einer Konzentration von 5 μg/ml in einer filtrierten 1 mg/ml fettsäurefreien Rinderserumalbumin-Lösung (BSA) in F12-Medium herstellen und bei -20 °C als 200 μl Aliquote lagern. Filtrieren Sie den NGF nach der Rekonstitution nicht.
- Falls keine Oberflächenmodifikation durchgeführt wurde, Deckgläser/-platten mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml für 15 min bei Raumtemperatur [RT]) und/oder Laminin (2-10 μg/cm2 für 2 Stunden bei 37 °C) beschichten, um die Neuronenbindung und das Neuritenwachstum zu unterstützen.
- Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung immer in einem Wasserbad bei 37 °C.
>2. Ernte und Dissoziation von Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG)
- Beenden Sie die Ratte durch Zervixluxation und Enthauptung. Rasieren Sie die Ratte und heben Sie die Haut an, um die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere die Wirbelsäule heraus und achten Sie dabei besonders auf die eingeklemmten Organe und Blutgefäße. Übertragen Sie die Wirbelsäule in eine biologische Sicherheitswerkbank (Klasse II) mit einer Petrischale und entfernen Sie einen eventuellen dorsalen Teil.
- Teilen Sie die Wirbelsäule entlang der Längsachse mit einer sterilen und scharfen chirurgischen Schere in zwei Hälften, um das Rückenmarksgewebe freizulegen. An dieser Stelle ist es hilfreich, die Wirbelsäule unterhalb des Brustkorbs in zwei kleinere Segmente zu schneiden, um die Handhabung während der DRG-Neuronenentnahme zu erleichtern. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig das gesamte Nabelschnurgewebe und achten Sie darauf, die DRG-Wurzeln nicht zu ziehen und zu entfernen. Auf diese Weise werden das DRG und die Wurzeln in den Wirbelkanälen freigelegt, die immer noch in der Säule eingeschlossen sind. Beobachten Sie DRG als weiße Filamente, die direkt aus den Kanälen austreten.
- Ziehen Sie die gesamte DRG-Wurzel (nicht nur das DRG) mit einer sehr feinen Pinzette aus den Wirbelkanälen heraus, indem Sie tief in die Wirbelkanäle eindringen und darauf achten, die Wurzeln der Ganglien nicht zu beschädigen. Das DRG in eine kleine Petrischale (60 mm2) mit 3-4 ml F12-Medium des Schinkens, zugegeben mit 1 % PS, geben. Wenn Sie verschiedene Tiere verwenden, verwenden Sie getrenntes Geschirr.
- Reinigen Sie das DRG unter einem Präpariermikroskop mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell von überschüssigen Nervenwurzeln, die die Ganglien umgeben, um die Kontamination der Gliazellen zu reduzieren. Die DRG in eine kleine Petrischale (35 mm2) mit 1,8 ml frischem F12-Medium geben.
- Zugabe von 200 μl 1,25 % Gew.-% Kollagenase Typ IV Stammlösung (Endkonzentration von 0,125 %) und Inkubation des DRG bei 37 °C, 5 % CO2 für 1 Std. Das Medium vorsichtig mit einer Glaspipette aspirieren, dabei darauf achten, dass das DRG nicht aspiriert oder beschädigt wird. Fügen Sie frisches F12-Medium hinzu, das mit 0,125 % Gew.-% Kollagenase Typ IV Enzym ergänzt ist, und inkubieren Sie 1 Stunde lang, wie zuvor beschrieben.
- Saugen Sie das Medium an und waschen Sie das DRG vorsichtig mit F12 Medium. Anschließend werden 1,8 ml F12-Medium und 200 μl Trypsin (Endkonzentration von 0,25 Gew.-%) zugegeben und 30 min lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie 1 ml F12-Medium hinzu, das mit 500 μl fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie das DRG dreimal vorsichtig mit F12 Medium, um Serumspuren zu entfernen.
- 2 ml frisches F12-Medium zugeben und das DRG mit dem Medium vorsichtig mit einer Glaspipette in ein 15-ml-Röhrchen umfüllen. Dissoziieren Sie die DRG-Neuronen vorsichtig, indem Sie mit der Glaspipette auf und ab pipettieren (ca. 8-10 Mal) (alternativ können Kunststoffspitzen verwendet werden).
- Lassen Sie das Pellet am Boden des Rohrs absetzen und sammeln Sie das Medium in einem neuen Rohr. Geben Sie 2 ml frisches F12-Medium in das Röhrchen mit dem Pellet und wiederholen Sie die mechanische Dissoziation mit der Glaspipette. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Suspension homogen ist (ca. 3-4 Mal) und sammeln Sie das gesamte dissoziierte DRG im neuen Röhrchen. Diese Methode reduziert den Stress, der von der mechanischen Dissoziation ausgeht, und verbessert die Lebensfähigkeit der Neuronen.
- Die resultierende homogenisierte Suspension wird mit einem 100-μm-Zellsieb in ein neues 15-ml-Röhrchen filtriert, um nicht dissoziierte Neuronen und andere Ablagerungen zu entfernen. In diesem Stadium könnte es zweckmäßig sein, zuerst die Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen zu filtrieren und dann die Lösung mit einer Glaspipette in das kleinere Röhrchen zu überführen. Die Suspension bei 110 g 5 min zentrifugieren.
- Bereiten Sie eine 15%ige BSA vor, indem Sie 500 μl einer 30%igen BSA-Lösung zu 500 μl F12-Medium hinzufügen. Pipettieren Sie die Lösung langsam an der Wand eines 15-ml-Röhrchens entlang, um eine allmähliche Proteinspur zu erzeugen. In dieser Phase ist es hilfreich, das Rohr in einem Winkel von 45° zu halten und das BSA langsam loszulassen, wobei die Zahlen auf dem Falcon-Rohr als Referenz für die sich bildende "Spur" verwendet werden.
- Der Überstand aus Schritt 2.10 wird abgesaugt, wobei 500 μl am Boden des Röhrchens verbleiben, und das Küvettenpellet wird in demselben Medium resuspendiert. Die Suspension wird entlang der zuvor in Schritt 2.11 vorbereiteten Proteinspur langsam pipettiert (die Zahlen auf dem Röhrchen als Referenz verwendet) und 5 min lang bei 500 g zentrifugieren.
- Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in 1 ml modifiziertem BS-Medium resuspendiert.
Anmerkung: Das Volumen für die Resuspendierung der DRG-Neuronen kann auf das tatsächlich benötigte Volumen aufgefüllt werden, abhängig von der gewünschten endgültigen Zellkonzentration und der Anzahl der zu säenden Proben. Ein Tier liefert genügend Zellen für ein 24-Well-Plattenexperiment.
- Die ausgesäten Proben werden 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Zellanheftung zu ermöglichen, und schließlich frisches BS-Medium hinzugefügt, das mit 50 ng/ml NGF ergänzt wird.
