>1. Erhaltung von Stammzellen
HINWEIS: Das unten beschriebene Zellerhaltungsprotokoll gilt für pluripotente Stammzellen (PSCs), die in einer adhärenten Monoschicht gehalten werden. Medien, andere Reagenzien und Zellkulturplatten, die vor der Behandlung mit Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet werden, können nach Bedarf angepasst werden. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten die Zellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank gehandhabt werden.
- Beschichten Sie sterile, mit Gewebekulturen behandelte Platten mit 6 Vertiefungen mit einer für pluripotente Stammzellen qualifizierten Matrix oder einem Substrat, das gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde, und inkubieren Sie mindestens 1 h in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre). Beschichtete Platten können mit Folie umwickelt und bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- Tauen Sie die kryokonservierten PSCs in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Sterilisieren Sie das Fläschchen mit Ethanol, bevor Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank einführen, und übertragen Sie die Zellen dann sofort durch Pipettieren in ein steriles konisches Röhrchen mit 5-10 Volumina vorgewärmtem Stammzellmedium.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml Stammzellmedium, das mit einem 10 μM rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor wie Y-27632 ergänzt wird.
- Aspirieren Sie die Kulturmatrix von der Platte und säen Sie die Zellen mit der gewünschten Dichte aus, typischerweise 0,5-1 x 106 Zellen pro Vertiefung in mindestens 2 ml Stammzellmedium pro Vertiefung.
Anmerkung: Die Plattierungsdichte kann über verschiedene Zelllinien und Klone hinweg variieren und sollte entsprechend optimiert werden.
- Pflegen Sie die Zellen, indem Sie sie täglich durch vorgewärmte Stammzellmedien ersetzen. Teilen Sie die Zellen bei etwa 70 % bis 80 % Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen.
- Für die Spaltung der Zellen aspirieren Sie das Medium und waschen die Zellen einmal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml einer Dissoziationsenzymlösung pro Vertiefung für 5-10 Minuten bei 37 °C.
- Waschen und resuspendieren Sie die Zellen mit vorgewärmten Stammzellmedien und geben Sie sie in ein steriles konisches Röhrchen mit 5-10 Volumina Stammzellmedien. Befolgen Sie die Schritte 1.3-1.7, um die Zellen zu plattieren.
>2. DMSO-Vorbehandlung
HINWEIS: Bei der Beschichtung der Zellen für die DMSO-Vorbehandlung vor der Differenzierung sollte die Zelldichte zu Beginn der Beschichtung unter Berücksichtigung der typischen Wachstumsrate der Stammzelllinie sowie des verwendeten Differenzierungsprotokolls optimiert werden. Validieren Sie die Pluripotenz bei Bedarf mit herkömmlichen Markern. Die Zellen sollten mindestens 1x-2x nach dem anfänglichen Auftauen vor der Differenzierung passageiert werden.
- Differenzierung der 2D-Kultur
- Wenn die Zellen eine geeignete Konfluenz erreichen, bereiten Sie beschichtete Platten vor, dissoziieren Sie die Zellen und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor, wie oben beschrieben.
- Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler mit Trypanblau oder einem anderen Viabilitätsmarker.
- Plattieren Sie die Zellen auf einer beschichteten 6-Well-Platte mit 0,5-1 x 106 Zellen pro Well in Stammzellmedien mit dem 10 μM ROCK-Inhibitor.
HINWEIS: Bei den in unserem Labor getesteten Zelllinien führten diese Dichten in der Regel zu 80%-90% konfluenten Zellen innerhalb der 24-stündigen DMSO-Vorbehandlung.
- Lassen Sie die Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren.
- Bereiten Sie 1%-2% DMSO in vorgewärmten Stammzellmedien vor (z. B. 100 μl DMSO in 10 mL Medien = 1 % DMSO-Lösung oder 200 μl DMSO in 10 ml Medien = 2 % DMSO-Lösung).
- Nach 24 Stunden Inkubation aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch DMSO-Lösung.
- Lassen Sie die Zellen vor der Differenzierung 24 bis 48 Stunden bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren.
HINWEIS: In der Regel ist eine 24-stündige DMSO-Behandlung bei den meisten humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzelllinien (ESC und iPSC) ausreichend. Zelllinien mit sehr langsamen Wachstumsraten (lange Verdopplungszeiten) können von der 48-stündigen Inkubation mit DMSO profitieren. Bei einer 48-stündigen Inkubation mit DMSO können die Medien nach den ersten 24 Stunden der Behandlung durch frische Stammzellmedien mit 1 % bis 2 % DMSO ersetzt werden.
>3. Unterscheidung zu primären Keimblättern
HINWEIS: Im Folgenden werden Methoden beschrieben, die sich zuvor in unserem Labor als wirksam erwiesen haben, für PSCs, die in einer Monoschicht auf 6-Well-Platten gezüchtet wurden. Ein beliebiges Differenzierungsprotokoll der Wahl sollte nach der DMSO-Behandlung verwendet werden, um die Differenzierung in die gewünschten Linien zu fördern. Entfernen Sie die DMSO-Lösung nach einer 24-48-stündigen Behandlung und fahren Sie mit der Differenzierung gemäß den Standardprotokollen fort.
- Differenzierung des Ektoderms
- Behandeln Sie die Zellen mit DMSO, wie oben für 2D-Kulturen beschrieben.
- Bereiten Sie Noggin und SB431542 Stammlösungen vor.
- Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsbasismedien her, indem Sie den Knockout-Serumersatz (KOSR) auf eine Endkonzentration von 10 % in Knockout-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) auflösen.
Anmerkung: Bereiten Sie genügend Basismedien für 3-4 Tage Medienwechsel vor.
- Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Noggin in eine Endkonzentration von 500 ng/ml und SB431542 in eine Endkonzentration von 10 μM in das entsprechende Volumen des vorgewärmten KOSR/Knockout-DMEM geben.
- Nach der DMSO-Vorbehandlung wird das Medium aus den Zellen aspiriert und durch Differenzierungsmedien ersetzt (z. B. 2 ml pro Well einer 6-Well-Platte).
- Lassen Sie die Zellen 3-4 Tage lang bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren und ersetzen Sie täglich das Medium durch frisch hinzugefügte Differenzierungsfaktoren.