$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung von Dissektionspuffern und Nährmedien
- Für die Isolierung des Rückenmarks der Ratte 100 ml Dissektionspuffer (1x PBS + 0,6 % Glukose + 2 % Penicillin-Streptomycin) vorbereiten und kühl stellen.
- 100 ml serumfreies Medium (SFM) zubereiten und bei 37 °C erwärmen. Zur Vorbereitung von SFM geben Sie 2 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin, 2% B27 und 10% Hormonmischung in das Neurobasal-A-Medium. Zur Herstellung der Hormonmischung stellen Sie ein 1:1 DMEM/F12-Medium her, das 0,6 % Glukose, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 μg/ml Insulin, 100 μg/ml Apo-Transferrin, 10 μM Putrescin, 30 nM Selen und 20 nM Progesteron enthält.
- Bereiten Sie das mit dem EFH-Wachstumsfaktor angereicherte Beschichtungsmedium vor (fügen Sie 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF und 2 μg/ml Heparin hinzu) und erwärmen Sie es bei 37 °C.
>2. Entnahme und Dissektion von periventrikulärem Rückenmarksgewebe adulter Ratte
- Sterilisieren Sie Präparierinstrumente in Ethanol und spülen Sie sie in steriler Kochsalzlösung oder autoklavieren Sie die Instrumente im Voraus. Geben Sie Ratten (6 - 8 Wochen alt) eine tödliche Injektion von Natrium-Pentobarbital (1 ml zu 65 mg/ml) oder eine Überdosis Anästhetikum (d. h. 4% Isofluran) gemäß dem von der Einrichtung genehmigten Tierprotokoll. Übergießen Sie den Rücken der Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut auf der Rückenfläche mit einer großen Präparierschere.
- Halten Sie die Schere senkrecht zur Rückenfläche und schneiden Sie quer die Wirbelsäule über den Hintergliedmaßen. Schneiden Sie mit einer kleineren Schere den über der Wirbelsäule liegenden Rückenmuskel in rostraler Richtung in Längsrichtung durch, um die Dornfortsätze freizulegen.
- Beginnend am freiliegenden kaudalen Ende führen Sie Rongeurs oder ein kleines stumpfes Knochenschneideinstrument extradur in die laterale Seite des Wirbelkanals in den Raum zwischen Rückenmark und Wirbelsäule ein. Machen Sie kleine Schnitte in die Lamina (knöcherne Bögen links und rechts der Dornfortsätze auf jeder Seite der Wirbel) und schälen Sie die Lamina vorsichtig ab, um das Rückenmark freizulegen (Abbildung 1A-D). Stellen Sie sicher, dass der Winkel der Klingen flach und parallel zum Rückenmark ist, damit das darunter liegende Rückenmark nicht beschädigt wird.
- Setzen Sie die Laminektomie in rostraler Richtung fort, um das thorakale und zervikale Rückenmark freizulegen.
- Schneiden Sie das Rückenmark vorsichtig mit einer stumpfen Gewebezange aus der Wirbelsäule heraus und verwenden Sie eine Mikroschere, um die Wurzeln vorsichtig zu durchtrennen, um die Nabelschnur zu lösen. Das exzidierte Rückenmark wird in eine Petrischale gelegt, die 4 °C sterilen Rattendissektionspuffer enthält (siehe Abschnitt 1.1). Spülen Sie das Gewebe mit einem frisch zubereiteten Präparierpuffer von 4 °C ab und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Schere quer in 1 cm große Segmente (Abbildung 1E).
- Halten Sie das Gewebe mit einer Hand mit einer feinen Pinzette fest. Mit der anderen Hand entfernen Sie mit einer Mikroschere vorsichtig die darüber liegenden Hirnhäute, die weiße Substanz und den größten Teil der grauen Substanz mit Hilfe eines Präparierzielfernrohrs. Alternativ können Sie eine feine Pinzette (Dumont #4) verwenden, um den größten Teil der grauen und weißen Substanz zu entfernen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks übrig bleibt, die das Ependym und eine kleine Menge der umgebenden grauen Substanz umfasst (Abbildung 1F-H).
- Das präparierte periventrikuläre Gewebe wird in eine 10 cm sterile Petrischale mit kaltem Rattendissektionspuffer gegeben.
>3. Isolierung und Kultivierung von NSPCs des Rückenmarks adulter Ratten
- Führen Sie die folgenden Schritte aseptisch in einer Laminar-Flow-Haube durch.
- Zerkleinern Sie das präparierte periventrikuläre Gewebe der Ratte mit einer Mikroschere in 1 mm große Stücke.
- Dissoziieren Sie das zerkleinerte Gewebe enzymatisch mit proteolytischen Enzymen unter Verwendung des Papain-Dissoziationskits, wie in der Tabelle der Materialien/Reagenzien angegeben.
Anmerkung: Die Reagenzkomponenten umfassen vier Fläschchen: Fläschchen 1: Earle's Balanced Salt Solution (EBSS). Fläschchen 2: Papain mit L-Cystein und EDTA. Durchstechflasche 3: Desoxyribonuklease I (DNase). Fläschchen 4: Ovomucoid-Protease-Inhibitor mit Rinderserumalbumin (BSA).
HINWEIS: Papain ist eine Sulfhydrylprotease mit breiter Spezifität für Proteinsubstrate. Das Papain wird aus dem Latex der Carica-Papaya-Pflanze gewonnen und baut die meisten Proteinsubstrate umfangreicher ab als Pankreasproteasen. Während des Dissoziationsprozesses kommt es zu Zellschäden, die dazu führen, dass DNA in das Dissoziationsmedium freigesetzt wird, was die Viskosität erhöht und das Pipettieren erschwert. Somit wird DNase in das Zellisolationsverfahren einbezogen, um die DNA zu verdauen, ohne die intakten Zellen zu schädigen. Ovomucoide sind Glykoprotein-Proteasehemmer, die zur Hemmung der Papainaktivität nach dem Dissoziationsschritt verwendet werden.
- Bei der ersten Anwendung wird das Albumin-Ovomucoid-Inhibitorgemisch (Durchstechflasche 4) mit 32 ml EBSS (Durchstechflasche 1) rekonstituiert, dann bei 4 °C gelagert und für nachfolgende Isolierungen verwendet. Anmerkung: Dies ergibt eine Lösung mit einer wirksamen Konzentration von 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml.
- Geben Sie 5 ml EBSS (Durchstechflasche 1) in die Durchstechflasche Papain (Durchstechflasche 2) und erhalten Sie eine Lösung von 20 Einheiten Papain/ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Vergewissern Sie sich, dass die Papain-Lösung klar erscheint, wenn sie vollständig aufgelöst ist. Andernfalls stellen Sie das Fläschchen für zehn Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis sich das Papain vollständig aufgelöst hat, um die Gesamtaktivität des Enzyms zu gewährleisten.
- Geben Sie 500 μl EBSS (Fläschchen 1) in das DNase-Fläschchen (Fläschchen 3) und mischen Sie vorsichtig, da DNase empfindlich auf Scherdenaturierung reagiert. Geben Sie 250 μl der DNase-Lösung in das Papain-Fläschchen, was zu einer Endkonzentration von ca. 20 Einheiten/ml Papain und 0,005 % DNase führt. Speichern Sie die verbleibende DNAse für die spätere Verwendung.
- Geben Sie das zerkleinerte Rattengewebe in die Papainlösung.
- Bei 37 °C unter ständigem Rühren auf einer Wippplattform inkubieren, um das Gewebe in der aktivierten Papainlösung zu dissoziieren. Inkubieren Sie das Rattengewebe 45 Minuten bis 1 Stunde lang.
- Zerreiben Sie die Mischung mit einer 10-ml-Pipette, um alle verbleibenden Gewebestücke zu dissoziieren und eine trübe Zellsuspension zu erhalten. Die Zellsuspension (keine undissoziierten Gewebestücke enthalten) in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen überführen und bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in einem Medium, das Ovomucoid, einen Papainhemmer, enthält.
- Bereiten Sie die Ovomucoid-Lösung vor, indem Sie 2,7 ml EBSS (Durchstechflasche 1) mit 300 μl der rekonstituierten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung (Durchstechflasche 4) in einem konischen 15-ml-Röhrchen mischen. 150 μl DNase-Lösung (Durchstechflasche 3) zugeben.
- Entsorgen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet sofort in der verdünnten DNase-Albumin-Inhibitor-Mischung.
- Trennen Sie intakte Zellen von den Zellmembranen durch Zentrifugation durch einen einstufigen diskontinuierlichen Dichtegradienten.
- Bereiten Sie den diskontinuierlichen Dichtegradienten vor, indem Sie 5 ml Albumin-Inhibitor-Lösung (Fläschchen 4) in ein 15-ml-Röhrchen geben und mit einer 5-ml-Pipette die Zellsuspension (wie oben beschrieben hergestellt) vorsichtig und langsam auf die Albumin-Inhibitor-Lösung aufschichten.
- Zentrifugieren bei 70 x g für 6 min bei RT.
Anmerkung: Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten sollte deutlich sichtbar sein, obwohl eine minimale Vermischung an dieser Grenze das Ergebnis nicht beeinflusst. Membranfragmente verbleiben an der Grenzfläche und dissoziierte Zellen pelletieren am Boden des Röhrchens.
- Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml EFH-Medium der Ratte (vorgewärmt auf 37 °C) resuspendiert. Zählen Sie die Dichte lebender Zellen mit einem Hämozytometer und plättieren Sie die Zellen in einen T25-Kulturkolben mit einer Dichte von 10 Zellen/μl bei EFH. Die typische Ausbeute von Zellen aus Rattengewebe beträgt etwa 2 x 106 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von etwa 80 %. Wenn klonale Kulturen gewünscht sind, werden Zellen mit einer Dichte von weniger als 10 Zellen/μl ausgesät. Die Kolben werden bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert und die Kulturen 1 Woche lang ungestört wachsen lassen, um eine Ansammlung von Kugeln zu vermeiden.
