Isolierung und Kultivierung von zerebralen Perizyten der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Mehra, A., et al., Eine Hochleistungsmethode zur Isolierung zerebraler Perizyten aus der Maus. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von zerebralen Perizyten aus einem Mäusegehirn. Die isolierten Zellen werden in perizytenspezifischen Medien kultiviert, um die Perizytenproliferation zu fördern.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie 500 ml Waschpuffer A (WBA) vor: 10 mM HEPES-Lösung in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 500 ml Waschpuffer B (WBB) vor: 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 10 mM HEPES-Lösung in HBSS. Bei 4 °C lagern.
3. Bereiten Sie 300 ml 30%ige Dextranlösung in WBA vor, indem Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur mischen. Autoklavieren Sie die Lösung vor Gebrauch 30 Minuten lang bei 110 °C. Lassen Sie die Lösung nach dem Autoklavieren 2-3 h bei Raumtemperatur ruhen. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
4. Bereiten Sie 100 ml 0,1%ige BSA-Lösung in kalter Dextranlösung vor. 3-4 min kräftig schütteln und bei 4 °C lagern.
5. Bereiten Sie den kompletten Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Nährmedium vor, indem Sie 20 % Kälberserum, 2 mM Glutamin, 50 μg/ml Gentamycin, 1 % Vitamine, 2 % Aminosäuren Basal Medium Eagle (BME) in basalen DMEM-Medien auflösen und bei 4 °C lagern. Vor der Verwendung 1 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) hinzufügen.
6. Bereiten Sie das vollständige Perinozytenmedium vor, indem Sie Perizytenwachstumszusätze (im Lieferumfang des Perinozytenmediums enthalten) und 20 % fötales Kälberserum (FCS) in das Basalmedium der Perizytenkultur geben und bei 4 °C lagern.

2. Wiederherstellung des Hirngewebes und Entfernung von Hirnhäuten

1. Verwenden Sie aus Gründen der Konsistenz bei jeder Extraktionscharge Mäuse ähnlichen Alters und gleichen Geschlechts. Nutzen Sie ein pathogenfreies Tierheim und ermöglichen Sie ad libitum den Zugang zu Wasser. Um die Effizienz und den minimalen Einsatz von Tieren zu gewährleisten, vermeiden Sie den Verlust von Gewebematerial.
2. Euthanasieren Sie C57BL/6J, 4-6 Wochen alt, männliche Mäuse (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankreich).
3. Schneiden Sie das Hirngewebe schnell unter sterilen Bedingungen heraus, um Schäden am Gewebe zu vermeiden. Legen Sie das Gewebe vorsichtig in 40 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
4. Übertragen Sie das Hirngewebe in kaltem PBS in eine Petrischale (100 mm x 15 mm).
5. Legen Sie das Hirngewebe auf ein steriles, trockenes, fusselfreies Tuch und entfernen Sie mit einer Pinzette mit gebogener Spitze das Kleinhirn, das Striatum und die Okzipitalnerven.
   1. Entfernen Sie alle sichtbaren Hirnhäute mit einem Wattestäbchen. Legen Sie das Hirngewebe auf den Kopf und öffnen Sie die Lappen mit einem Wattestäbchen mit leichten Strichen nach außen. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße.
   2. Legen Sie das meningfreie Hirngewebe in eine Petrischale (100 mm x 15 mm) mit 15 mL kaltem WBB.

>3. Homogenisierung

1. Übertragen Sie das Gewebe in ein Mörserröhrchen der Dounce Gewebeschleifmaschine und fügen Sie 3-4 mL WBB mit einer Pinzette hinzu.
2. Das Taschentuch mit einem "losen" Stößel 55 Mal zerkleinern. Spülen Sie den "losen" Stößel mit WBB ab. Nun die Gülle mit einem "festen" Stößel 25 Mal zerkleinern.
3. Die Gülle gleichmäßig auf zwei 50-ml-Röhrchen aufteilen und das 1,5-fache Volumen kaltes 30 %iges BSA-Dextran hinzufügen, wobei die Röhrchen kräftig geschüttelt werden, um die Aufschlämmung zu mischen.

>4. Isolierung der vaskulären Fraktion

1. Nach kräftigem Schütteln der Röhrchen zentrifugieren Sie die Röhrchen für 25 min bei 3.000 x g und 4 °C.
2. Übertragen Sie den Überstand (zusammen mit der oberen Myelinschicht) auf 2 neue Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen 25 Minuten lang bei 3.000 x g und 4 °C. Bewahren Sie die Pellets aus der ersten Zentrifugation auf, indem Sie 3 mL kaltes WBB hinzufügen (halten Sie das Pellet bei 4 °C).
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 und bewahren Sie die Pellets aus der 2. Zentrifugation sorgfältig auf.
4. Das Dextran und das Myelin mit Geweberesten aus den Röhrchen aus Schritt 4.3 entsorgen. Bewahren Sie die Pellets in kaltem WBB auf.
5. Der Inhalt von Röhrchen 1 und Röhrchen 2 aus Schritt 4.1 wird gepoolt und mit kaltem WBB auf ein Endvolumen von 10 mL aufgefüllt.
6. Wiederholen Sie diesen Schritt für Schläuche aus Schritt 4.2 und Schritt 4.3.
   HINWEIS: Zum Schluss gibt es noch 3 Röhrchen aus 3 Zentrifugen.
7. Dissoziieren Sie das Pellet mit einer 10-ml-Pipette in 6 Auf- und Ab-Bewegungen, bis keine sichtbaren Pelletklumpen mehr übrig sind.
8. Filtern Sie die Zellsuspensionen jedes Röhrchens mit einer Vakuumfilterbaugruppe und einem Nylongewebefilter.
   Anmerkung: Dieser Filtrationsschritt ist wichtig, um längere/größere Gefäße über den Siebfilter zu entfernen.
9. Erholen Sie die Kapillaren und resuspendieren Sie sie, indem Sie den Filter mit Hilfe einer Flachpinzette oder eines Schabers in WBB bei Raumtemperatur abkratzen. Filtern Sie die Suspension mit einem frischen Filter, um mehr Kapillaren zurückzugewinnen
10. Das Filtrat gleichmäßig auf zwei Röhrchen verteilen und 7 min bei 1.000 x g und RT.
    zentrifugieren HINWEIS: Bereiten Sie während dieses Zentrifugationsschritts die enzymatische Lösung vor. Bestimmen Sie das erforderliche Volumen an WBB in Abhängigkeit von der Anzahl der verwendeten Tiere (siehe Materialtabelle). 1x DNase 1 und 1x Tosyl-L-Lysylchlormethanhydrochlorid (TLCK) (siehe Materialtabelle) in WBB geben und auf 37 °C vorwärmen.
11. Die Pellets aus Schritt 4.10 werden in einem Röhrchen mit vorgewärmtem WBB mit Enzymen aufgefangen. Fügen Sie vorgewärmte 1x Kollagenase/Dispase hinzu. Legen Sie die Tube für genau 33 min in das 37 °C heiße Wasserbad des Schütteltisches.
12. Stoppen Sie die Enzymreaktion, indem Sie 30 mL kaltes WBB hinzufügen. Die Suspension wird 7 min lang bei 1.000 x g und RT zentrifugiert.
13. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und dissoziieren Sie das Pellet in WBB mit 6 Auf- und Abbewegungen mit einer 10-ml-Pipette. Dieser Schritt sollte weniger rigoros und vergleichsweise schneller sein.
14. Die Suspension wird 7 min lang bei 1.000 x g und RT.
    zentrifugiert. HINWEIS: Entsorgen Sie während dieses Schritts die Beschichtung aus den Kulturschalen und spülen Sie sie einmal bei Raumtemperatur mit DMEM ab. Zellkulturschalen mindestens 1 h bei RT beschichten.
15. Der Überstand wird aus dem in Schritt 4.14 erhaltenen Röhrchen verworfen und das Pellet in einem neuen vollständigen DMEM-Medium dissoziiert, die Zellen (Tag 0, P0) in 9 Vertiefungen mit 6-Well-Platten (1 Vertiefung mit je 9,6 cm2) plattiert.

>5. Proliferation zerebraler Perizyten

1. Halten Sie die Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem sterilen Inkubator. Ersetzen Sie das Nährmedium nach 24 Stunden (Tag 1) der Beschichtung der Zellen, indem Sie die Ablagerungen vorsichtig entfernen. Nach Tag 1 wechseln Sie die Nährmedien alle 48 Stunden.
2. Beobachten Sie die Zellkultur mindestens 7-8 Tage lang. Zu diesem Zeitpunkt sollten zelluläre Wucherungen auf der Oberseite der endothelialen Einschicht beobachtbar sein.
3. Passage der Zellen an Tag 8-10 (abhängig von der Konfluenz) in Perizyten-Kulturmedium bis Passage 1 (P1) auf gelatinebeschichteten Kulturplatten. Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage. Beobachten Sie die Zellen 6-7 Tage lang. Die Zellen werden nacheinander wieder auf Passage 2 (P2) an Tag 17 gespalten [und Passage 3 (P3) nur bei Bedarf an Tag 24], gezüchtet in Perozytenmedium in gelatinebeschichteten Platten.
   Anmerkung: Die Zellen sollen bei einer Konfluenz von nahezu 80-90 % für Experimente/Beobachtungen bereit sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aminosäuren BME	Sigma	Nr. B-6766	Bei 4 °C lagern.
Basale DMEM-Medien	Invitrogen	316000083	Bei 4 °C lagern.
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Sigma	Nr. F-0291	Bei -20 °C lagern.
Bsa	Sigma	Nr. A-8412	Bei 4 °C lagern.
Kollagenase-Dispase	Sigma	10269638001	Bereiten Sie eine 10-fache Stammlösung in steriler PBS-CMF vor. Die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter filtrieren und bei -20 °C lagern. Hinweis: Für den Enzymaufschlussschritt des Protokolls sind für jeden Satz von 10 Mäusen für die Extraktion 300 μl 10x Kollagenase-Dispase erforderlich.
Dextran	Sigma	Artikel-Nr.: 31398
DNase I	Sigma	11284932001	Bereiten Sie eine 1000X-Stammlösung vor, indem Sie 100 mg in 10 ml sterilem Wasser auflösen und bei -20 °C lagern.
Gelatine	Sigma	G-2500	Bereiten Sie die Arbeitsschicht vor, indem Sie eine 0,2%ige Gelatinelösung in sterilem PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4) herstellen. Die Lösung mindestens 20 Minuten bei 120 °C autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Kulturschalen mindestens 4 Stunden bei 4 °C überziehen.
Gentamycin	Biochrom AG	Nr. A-2712	Bei 4 °C lagern.
Glutamin	Merck	Nr. I.00289	Bei -20 °C lagern.
HBSS	Sigma	Nr. H-8264	Bei 4 °C lagern.
HEPES	Sigma	Nr. H-0887	Bei 4 °C lagern.
Matrigel	BD Biocoat	Artikel-Nr.: 354230	Bereiten Sie eine Arbeitsbeschichtungslösung aus Matrigel vor, indem Sie das Material in kaltem DMEM im Verhältnis 1:48 mit einer Endkonzentration von 85 μg/cm2 verdünnen. Zellkulturschalen sollten mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur beschichtet werden.
Perizyt Medium-Maus	Forschungslabore von Sciencell	Nr. 1231	Bei 4 °C lagern.
Tosyllysin Chlormethylketon	Sigma	T-7254	Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung in WBA vor, indem Sie 16 mg in 10,88 ml WBA auflösen, um eine 4 mM-Lösung herzustellen und bei 4 °C zu lagern.
Vitamine	Sigma	Nr. B-6891	Bei -20 °C lagern.
Filtrations-Werkzeuge	Sefar, Nylonnetz, Porosität von 60 Mikron
Laborausstattung	Ausschwingrotor-Zentrifuge
Wasserbad mit Rührwerk
Laminar-Flow-Haube : BSL2
Glaswaren (alle Komponenten müssen wärmesterilisiert werden)	Dounce Gewebeschleifer mit Glasstößel
Stößel I: 0,0035 - 0,0065 Zoll
Stößel II: 0,0010 - 0,0030 Zoll
Vakuumfilterbaugruppe mit Filterstützbasis aus grobem Frittenglas