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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Bereiten Sie die Enzymmischung 1 und 2 für jede Probe vor
HINWEIS: Für Volumina über 2 ml verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette; für Volumina von 200 μl-2 ml verwenden Sie eine 1000 μl Pipette; für Volumina von 21-199 μl verwenden Sie eine 200 μl Pipette; verwenden Sie für Volumina von 2-20 μl eine 20 μl Pipette; verwenden Sie für Volumina unter 2 μl eine 0-2 μl Pipette.
- Für jede Probe wird je ein Aliquot von Enzym P und Enzym A bei Raumtemperatur aufgetaut.
- Kombinieren Sie für Enzymmischung 1 50 μl Enzym P und 1900 μl Puffer Z in einem markierten C-Röhrchen (Materialtabelle).
- Für Enzymmischung 2 fügen Sie 20 μl Puffer Y zu den aufgetauten 10 μl Aliquot von Enzym A hinzu.
>2. Dissoziationsprotokoll für das Gehirn von Erwachsenen
HINWEIS: Bei der Arbeit mit Proben sollten die Röhrchen in einem Röhrchengestell bei Raumtemperatur platziert werden, während BSA und D-PBS auf Eis bleiben, sofern nicht anders angegeben.
- Schalten Sie den Dissoziator ein.
- Übertragen Sie die Hippocampus-Gewebestücke mit einer Pinzette in die C-Sonde.
- Übertragen Sie 30 μl Enzymmischung 2 in das C-Röhrchen. Drehen Sie die Kappe, bis die Spannung zu spüren ist, und ziehen Sie sie dann fest, bis sie einrastet.
- Platzieren Sie das C-Rohr mit dem Kopf nach unten in einer Position des Dissoziators. Die Probe erhält den Status "Ausgewählt" (Abbildung 1). Befestigen Sie die Heizung über dem C-Rohr.
- Drücken Sie auf das Ordnersymbol, wählen Sie den Ordner Favoriten, scrollen Sie zum 37C_ABDK_02 Programm und wählen Sie es aus. Klicken Sie auf OK, um das Programm auf alle ausgewählten C-Röhren anzuwenden, und tippen Sie dann auf Start (Abbildung 1).
- Beschriften Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen pro Probe.
- Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf jedes konische 50-ml-Röhrchen und befeuchten Sie es mit 2 mL BSA-Puffer.
- Entfernen Sie nach Abschluss des Programms die Heizung und das C-Rohr aus dem Dissoziator.
- Geben Sie 4 mL BSA-Puffer in die Probe und tragen Sie die Mischung auf das Zellsieb auf dem konischen 50-ml-Röhrchen auf.
- Geben Sie 10 mL D-PBS in das C-Rohr, schließen Sie es und schwenken Sie die Lösung vorsichtig. Tragen Sie es auf das Zellsieb auf dem konischen 50-ml-Röhrchen auf.
- Entsorgen Sie das Zellsieb und das C-Rohr. Die Suspension bei 300 x g für 10 min bei 4°C zentrifugieren. Aspiriere dann den Überstand und verwerfe ihn.
>3. Beseitigung von Schutt
- Das Pellet wird mit 1550 μl kaltem D-PBS resuspendiert und die Suspension in ein beschriftetes konisches 15-ml-Röhrchen überführt.
- Geben Sie 450 μl kalte Lösung zur Entfernung von Schmutz hinzu und pipettieren Sie auf und ab (nicht vortexen).
Anmerkung: Debris Removal Solution ist ein Reagenz im kommerziellen Brian Dissoziationskit für Erwachsene.
- Legen Sie vorsichtig 1 ml kaltes D-PBS auf die Zellsuspension und halten Sie die Spitze an der Wand des konischen Röhrchens. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Gesamtüberlagerung 2 ml beträgt< br />
Anmerkung: Dieser Schritt ist entscheidend. Führen Sie mit Geschicklichkeit und Geschicklichkeit aus.
- Zentrifugieren bei 3000 x g für 10 min bei 4°C mit voller Beschleunigung und voller Bremse.
Anmerkung: Wenn die Phasen nicht klar voneinander getrennt sind, wiederholen Sie die Schritte 7.2-7.3. Ein letztes Mal bei 1000 x g für 10 min bei 4°C zentrifugieren.
- Die Suspension sollte nun aus drei verschiedenen Schichten bestehen (Abbildung 2). Saugen Sie die oberste Schicht an. Streichen Sie mit der Pipettenspitze hin und her, um die weiße mittlere Schicht abzusaugen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der mittleren Schicht, ohne die unterste Schicht zu stören.
Anmerkung: Dieser Schritt ist entscheidend. Führen Sie mit Geschicklichkeit und Geschicklichkeit aus.
- Fügen Sie 2 ml kaltes D-PBS hinzu und pipettieren Sie es zum Mischen auf und ab.
- Zentrifugieren bei 1000 x g für 10 min bei 4°C mit voller Beschleunigung und voller Bremse. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Das Pellet wird in 1 ml BSA-Puffer resuspendiert.
HINWEIS: Die Zellen können in dem entsprechenden Puffer resuspendiert und dann magnetisch markiert und isoliert werden, um die Einzelzellsequenzierung vorzubereiten.
