Herstellung einer einzelligen Suspension von Immunzellen aus murinem Hirngewebe

Zusammenfassung

Quelle: DiSano, K. D., et al. Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgelagerte Analyse von Immunzellen. J. Vis. Exp. (2020).

Das Video zeigt die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Immunzellen aus einem murinen Gehirngewebe. Es beinhaltet eine enzymatische Verdauung, um Zellen aus dem Gehirngewebe freizusetzen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Immunzellen basierend auf ihrer Dichte zu isolieren und die Einzelzellsuspension zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Hirn- und Rückenmarksgewebe

1. Übertragen Sie das Gehirn- oder Rückenmarksgewebe mit dem Medium auf die Oberseite der 100-mm-Petrischale, indem Sie das Gewebe und das Medium aus dem Röhrchen gießen. Bewege das Gewebe mit einer Pinzette zum Boden der Petrischale. Hacken Sie das Gehirn oder das Rückenmark mit einer sterilen Rasierklinge fein. Bewegen Sie das zerkleinerte Gewebe mit der Rasierklinge an den Boden der Platte, indem Sie es abkratzen, um das Gewebe zu sammeln.
   Anmerkung: Für das untenstehende enzymatische Verdauungsprotokoll können bis zu zwei Rückenmark zur Verarbeitung zusammengelegt werden. Gehirne sollen individuell bearbeitet werden.
2. Geben Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 3 ml RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium (ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS)) in die Petrischale. Pipettieren Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette nach oben und unten, um das Gewebe im Medium wieder zu resuspendieren, und übertragen Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   Anmerkung: Wenn es sich bei der Downstream-Anwendung um Einzelzell- oder Bulk-RNA-Sequenzierungsanalysen oder Zellkulturen handelt, sollten FCS-Chargen getestet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen vor der Analyse nicht aktiviert werden. Alternativ können Zellen mit 1x PBS mit 0,04 % BSA anstelle von RPMI mit 10 % FCS verarbeitet werden.
3. Waschen Sie die Petrischale mit einer serologischen 10-ml-Pipette mit zusätzlichen 2 ml Medium, um das restliche Gewebe aufzufangen, und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erhalten. Halten Sie die Tuben zwischen den Verarbeitungsschritten auf Eis.
4. Resuspendieren Sie das Kollagenase I-Pulver mit einer Pipette in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) -Medien, um die gewünschte Konzentration (d. h. 100 mg/ml) zu erhalten. Geben Sie Kollagenase Typ I in das konische Röhrchen, das die zerkleinerte Gewebeprobe enthält, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten (d. h. 50 μl für 1 mg/ml).
   Anmerkung: Höhere Konzentrationen von Kollagenase erhöhen die Zellausbeute, können aber Marker auf der Zelloberfläche spalten. Daher sollten Kollagenase I-Chargen titriert werden, um die optimale Konzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um die höchste Anzahl lebensfähiger Zellen mit allen erforderlichen Zelloberflächenmarkern zu erhalten. Zum Beispiel wurde Kollagenase I in Endkonzentrationen von 0,5 mg/ml, 1 mg/ml und 2 mg/ml an einzelnen Gehirn- oder Rückenmarksproben getestet. Die Zellviabilität wurde mit der Trypanblau-Ausschlussmethode bestimmt und die Zelloberflächenmarker CD45, CD19 und CD4 wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Eine Konzentration von 1 mg/ml Kollagenase I ergab die höchste Anzahl lebender Zellen bei gleichzeitiger Beibehaltung aller interessierenden Zelloberflächenmarker. Daher wurde diese Konzentration für weitere Experimente zur Untersuchung dieser Zelltypen verwendet.
5. DNase I-Pulver wird vorsichtig mit 0,15 M Natriumchlorid auf die gewünschte Stammkonzentration resuspendiert. Geben Sie die resuspendierte DNase I in das konische Röhrchen, das die zerkleinerte Gewebeprobe enthält, um eine Endkonzentration von 20 U/ml zu erhalten< br /> Anmerkung: DNase I-Chargen variieren je nach Aktivitätseinheit pro ml. Die Konzentration, die der Gewebeprobe zugesetzt werden soll, ändert sich je nach den Aktivitätseinheiten des Vorratsfläschchens pro Milliliter. Die gewünschte Endkonzentration pro Probe beträgt 20 U/ml.
6. Legen Sie die Röhrchen in ein Röhrchengestell in ein 37 °C heißes Wasserbad und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang. Drehen Sie die Röhrchen alle 15 Minuten um, um das Gewebe gründlich mit den Enzymen zu vermischen. Nach der Inkubation geben Sie 500 μl 0,1 M EDTA (pH = 7,2) in jedes Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,01 M EDTA und inkubieren Sie weitere 5 Minuten, um die Kollagenase zu inaktivieren.
7. Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette 9 ml RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, zu jedem Röhrchen, um das Volumen jedes Röhrchens auf ~14,5 ml zu erhöhen. Zentrifugieren Sie bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette unter Vakuum ab und achten Sie darauf, das Küvettenpellet nicht zu berühren.
8. Geben Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 3 ml 100 % isotonische Stamm-Dichtegradientenlösung in das Röhrchen mit dem Zellpellet. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette zusätzliches RPMI 10 % FCS-Medium hinzu, um das endgültige Volumen auf 10 ml zu erhöhen, und resuspendieren Sie das Zellpellet, um eine isotonische Stammdichtegradienten-Lösungsschicht von 30 % zu erzeugen.
   Anmerkung: Bereiten Sie das isotonische Dichtegradientenmedium mit 100 % Stamm im Voraus vor, aliquotieren Sie es und lagern Sie es bis zu 3 Monate lang bei 4 °C. Zur Herstellung der 100%igen isotonischen Dichtegradientenlösung verdünnen Sie das Dichtegradientenmedium (Materialtabelle) mit einem Dichtegradientenmedienverdünnungspuffer. Bereiten Sie den Dichtegradienten-Medienverdünnungspuffer vor (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na₂HPO₄, 0,20 g/L KH₂PO₄; 20,0 g/L Glukose) und sterilisieren Sie ihn mit einem Vakuumfiltersystem. Stellen Sie die 100%ige isotonische Dichtegradientenlösung her, indem Sie 1 Teil des Dichtegradientenverdünnungspuffers und 9 Teile Dichtegradientenmedium mischen. Gut mischen.
9. Drehen Sie jedes Rohr gut um und mischen Sie es, bevor Sie die 70%ige isotonische Dichtegradientenunterlage hinzufügen. Führen Sie eine serologische 1-ml-Pipette mit 1 ml 70%iger isotonischer Stamm-Dichtegradientenlösung in den Boden des Röhrchens ein. Unterlegen Sie langsam 1 ml der Lösung und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden. Nehmen Sie die serologische Pipette langsam aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören.
   Anmerkung: Für die 70%ige Unterlage sollte die 100%ige isotonische Stammdichtegradientenlösung mit RPMI-Medien auf 70% verdünnt werden (d. h. 7 ml 100%ige isotonische Stammdichtegradientenlösung und 3 ml RPMI-Medium gut gemischt). Darüber hinaus ist die Schaffung einer sauberen, ungestörten 70%-Unterlage unerlässlich für die Entfernung von Myelinablagerungen und für die Gewinnung reiner einzelliger Suspensionen an der Gradientengrenzfläche nach der Zentrifugation.
10. Zentrifugieren bei 800 x g für 30 min bei 4 °C ohne Bremse. Aspirieren Sie den Überstand, einschließlich der Myelin-Trümmerschicht, bis 2–3 ml im Röhrchen verbleiben, und achten Sie darauf, die Zellschicht nicht zu stören. Entnehmen Sie die Zellschicht zwischen dem Dichtegradienten von 30/70 % mit einer 1-ml-Pipette und geben Sie sie in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
11. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette RPMI 10 % FCS-Medium hinzu, um das endgültige Volumen auf 15 ml zu erhöhen. Zentrifugieren Sie 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    Anmerkung: In diesem Schritt können bei Bedarf Zellschichten aus zwei Röhrchen gepoolt werden. Poolen Sie nicht mehr als zwei Röhrchen, da die Zellen sonst aufgrund einer hohen Gradientenmedienkonzentration mit hoher Dichte nicht pelletieren.
12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, um das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen/Puffer, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen (z. B. resuspendieren Sie ein einzelnes Rückenmark in 250 μl FACS-Puffer für die nachgeschaltete Oberflächenfärbung) (Abbildung 1).
13. Übertragen Sie die Zellsuspensionen mit einer 1-ml-Pipette auf den oberen Rand eines Filterröhrchens (Materialtabelle) und lassen Sie die Zellen zum Boden des Röhrchens filtrieren, um verbleibende Myelinreste zu entfernen.
14. Verwenden Sie einen Trypanblau-Ausschlussfarbstoff, verdünnen Sie ihn und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer, indem Sie mindestens zwei 16-Quadrat-Gitter mitteln, um die Genauigkeit zu gewährleisten40,41.
15. Fahren Sie mit der gewünschten Einzelzellanalysetechnik fort.
    Anmerkung: Mit verschiedenen Formen der Kollagenase (d. h. D, Typ I, Typ II, Typ IV) können Immunzellen, Mikroglia (Abbildung 1), Astrozyten, Perizyten, Endothelzellen49 und Neuronen50 effizient isoliert werden. Die für die Ergebnisse erhaltenen Keimzellzahlen waren unter Verwendung des titrierten Kollagenase I-Enzyms wie folgt: Ganzes scheinbehandeltes Gehirn = 500.000–600.000 Zellen; Gesamtes TMEV-IDD-Gehirn = 800.000–1.000.000 Zellen; Ganzes scheinbehandeltes Rückenmark = 150.000–200.000 Zellen; Gesamtes TMEV-IDD-Rückenmark = 300.000–400.000. Die Zellzahlen variieren je nach Präzision der Entnahme, Verarbeitung und ob eine ZNS-Entzündung vorliegt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Identifizierung von CD45hi-infiltrierenden Immunzellen in ZNS-Geweben. (A) Gating-Strategie zur Identifizierung von CD45hi-infiltrierenden Immunzellen (P1), CD45lo-Mikroglia (P2) und CD45-Oligodendrozyten, Astrozyten und Neuronen unter den insgesamt lebenden Zellen im Rückenmark von scheinbehandelten (rot) oder TMEV-IDD-Mäusen (blau). Minimale CD45hi-Zellen wurden in scheinbehandel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin	ThermoFisher Scientific	37002D
Zentrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-12R Zentrifuge
Kollagenase I	Worthington	LS004196
Konisches Röhrchen, 15 mL	VWR	Tel.: 525-1069
Konisches Röhrchen, 50 mL	VWR	Tel.: 89039-658
Deckglas	Hauser Scientific	5000
Gebogene Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11003-14
Einweg-Tube aus Polystyrol, 14 mL	Fisher Scientific	Tel.: 14-959-1B
DNase I	Worthington	LS002139
Trockeneis	Airgas	N/A
Durmont #7Forceps	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11271-30
EDTA-Dinatriumsalz-Dihydrat	Amresco	0105-500g
Ethanol, 100%	jegliche	N/A
Filter Oberrohr, 5 mL	VWR	352235
Fixierbare Lebensfähigkeitsbeize 780	Becton Dickinson	565388
Traubenzucker	Fisher Chemical	Nr. D16-500
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV (Englisch
Hämazytometer	Andwin Scientific	Tel.: 02-671-51B
Gefäßklemme	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 13004-14
HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure)	ThermoFisher Scientific	15630080
Kcl	Fisher Chemikalie	Nr. BP366-500
KH2PO4 (wasserfrei)	Sigma Aldrich	Nr. P5655-100G
Flüssigstickstoff	Airgas	N/A
Maus FC-Block (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (wasserfrei)	Fisher Chemical	Nr. S374-500
NaCl	Fisher Chemikalie	Nr. S671-500
Nadel, 25 Gauge	Becton Dickinson	305122
Normales Mausserum	ThermoFisher Scientific	31881
Nylon-Mesh-Sieb	VWR	Artikel-Nr.: 352350
Okt	Sakura	Artikel-Nr.: 4583
Paraformaldehyd, 20%	Elektronenmikroskopie	15713-S	Verdünnt auf 4 % mit 1 x PBS
Pasteurpipette, 9 Zoll, unplugged	Fisher Scientific	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	21-040-CV
PE Ratte Anti-Maus CD4	Becton Dickinson	Artikel-Nr.: 553730
PE-CF594 Ratte Anti-Maus CD19	Becton Dickinson	562329
Percoll-Dichtegradienten-Medien	GE Gesundheitswesen	Artikel-Nr.: 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Ratte Anti-Maus CD45	Becton Dickinson	550994
Petrischale, 100 mm	VWR	353003
pH-Messgerät	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 13-636-AB150
Pipet-Hilfe	Drummond Scientific Corporation	Tel.: 4-000-101
Pipette 200 μl	Gilson	FA10005M
Pipettenspitzen, 1 mL	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1111-2831
Pipettenspitzen, 200 μl	USA Wissenschaftlich	Nr. 1111-1816
Pipette, 1 mL	Gilson	FA10006M
Verlängern Sie den Diamanteindecker mit DAPI	ThermoFisher Scientific	Nr. P36962
Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Kaninchen Anti-Maus CD3 (SP7 Klon)	Abcam (Englisch	AB16669
Kaninchen Anti-Maus Laminin	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: ab11575
Anti-Maus für Ratte ERT-R7	Abcam (Englisch	AB51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Serologische Pipette, 1 mL	VWR	357521
Serologische Pipette, 10 mL	VWR	357551
Serologische Pipette, 5 mL	VWR	357543
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	Nr. S318-100
Saccharose	Fisher Chemikalie	S5-500
Chirurgische Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14001-16
OP-Schere, extra fein	Roboz	RS-5882
Spritze, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Spritze, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Trypan-Blau	Gibco	Tel.: 15250-061

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