Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung der Soft-Light-Lampe (Tag 1)
- Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3-0,5 cm in der Größe von A5-Papier. Weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte kleben.
- Installieren Sie eine Reihe weißer LED-Leuchten am Rand der Platte, so dass die Leuchten von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können (Abbildung 1A-F, Abbildung 2B).
Anmerkung: Da die Durchmesser von EBs im Frühstadium etwa 200 μm bis 300 μm betragen, ist es schwierig, sie mit bloßem Auge unter der Leuchtstofflampe sauberer Bänke klar zu erkennen. Im Gegensatz dazu können wir aufgrund der Verstärkung der diffusen Reflexion die EBs mit seitlich beleuchtetem weichem Licht eindeutig detektieren (Abbildung 2B, C). Für EB-Kulturen in nachfolgenden Experimenten wird eine 6-Well-Platte empfohlen. Um die visuelle Wirkung von weichem Licht jedoch besser zu zeigen, werden in dieser Studie anstelle von Tellern manchmal Geschirr zum Fotografieren und Filmen verwendet, also bitte nicht falsch verstehen. Die seitlich beleuchtete Softlichtlampe kann auch für die 6-Well-Platte verwendet werden.
>2. EB-Transfer und Mediumwechsel (Tage 2-5)
- Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion vor und geben Sie 2 ml Embryoidkörper (EB)-Bildungsmedium in jede Vertiefung
.
- Entfernen Sie die EBs zusammen mit dem Medium mit einer 1000 μL Pipettenspitze mit breiter Bohrung (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie auf die 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion (~100 EBs/Well).
Anmerkung: Der Betriebsprozess verwendet eine weiche Lichtlampe (siehe Schritt 1), um die Beobachtung der EBs zu erleichtern. Schalten Sie andere Lichtquellen in Innenräumen aus, um die visuelle Wirkung des weichen Lichts zu verbessern.
- Ersetzen Sie es jeden Tag durch die gleiche Menge frisches EB-Bildungsmedium. Verwenden Sie die Sekundärströmung, um die EBs in der Mitte zu sammeln und das Medium zu wechseln.
- Aspirieren Sie das alte Medium, indem Sie langsam an den Rand der Vertiefung pipettieren. Saugen Sie nicht zu fest; Andernfalls werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann frisches Medium hinzu, um die EBs zu resuspendieren.
Anmerkung: Die prinzipielle Sekundärströmung (Abbildung 2D). Induzieren Sie eine Wirbelströmung, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Durch die Drallströmung wird eine Sekundärströmung induziert und in Richtung Zentrum gerichtet. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung zum Zentrum der Vertiefung, wonach der Mediumwechsel oder der Embryoidtransfer problemlos durchgeführt werden kann.
>3. Neuronale Induktion (Tage 5-7)
- Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion vor und geben Sie 3 ml neuronales Induktionsmedium (Tabelle 1) in jede Vertiefung
.
- Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein (siehe Schritt 1) und schalten Sie andere Lichtquellen in Innenräumen aus.
- Übertragen Sie die EBs auf die 6-Well-Platte mit zusätzlichem neuronalem Induktionsmedium (~100 EBs/Well). Geben Sie so wenig wie möglich des ursprünglichen Mediums in die neue Vertiefung.
Anmerkung: Führen Sie einfache Fähigkeiten des Organoid-Transfers ein. Unter der Schwerkraft und mit einer relativ höheren Dichte als das Medium sinken die resuspendierten EBs natürlich allmählich ab, indem sie den in Abbildung 2E gezeigten Vorgang anwenden. Somit können die EBs bequem übertragen werden. Da freie Zellen und tote Zellfragmente im Vergleich zu EBs langsamer absinken, können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente durch diese Sedimentationsmethode entfernt werden (Abbildung 2F).
- Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h.
Anmerkung: Unter dem Mikroskop betrug der Durchmesser der EBs etwa 500 μm, und der Rand war durchscheinend, was darauf hindeutet, dass sich eine neuroepitheliale Schicht gebildet hat.
Tabelle 1. Zusammensetzung des neuronalen Induktionsmediums
| Komponenten | Volumen |
| DMEM-F12 | 97 mL |
| N2-Ergänzung | 1 mL |
| Glutamax-Ergänzung | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| Heparin | Endkonzentration 1 μg/mL |
