>1. Nährmedien und Werkzeugvorbereitung
- Bank und Arbeitsbereich mit 70% Ethanol besprühen und trocknen lassen.
- Besprühen Sie die Sezierwerkzeuge, die Pinzette und zwei Uhrenschalen aus Glas mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf der Bank trocknen.
- Stellen Sie das ergänzte Schneider-Medium (SSM, Tabelle 1) her und legen Sie es auf Eis.
- Pipettieren Sie jeweils 1 ml SSM in die Glasschalen.
- Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der PBS-Platte in die SSM in der ersten Glasuhrenschale. Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven mit einer Mikropipette mit steriler Spitze in das SSM in die zweite Glasuhrenschale.
2. Sektionen und Gehirnkulturen
- Sobald sich die Larven in der zweiten gläsernen Uhrenschale mit SSM befinden, sezieren Sie die Gehirne mit einer Pinzette und einem Präpariermikroskop aus den Larven. Passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf an.
- Fassen Sie mit einer Pinzette die Mundhaken und mit der anderen den Körper vorsichtig auf halber Höhe und ziehen Sie in die entgegengesetzte Richtung (Abbildung 1), um die Larve in zwei Teile zu spalten.
Anmerkung: Das Gehirn befindet sich direkt hinter den Mundhaken. Beachten Sie, dass es andere Gewebe geben kann, die das Gehirn umgeben. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie dieses Gewebe entfernen, da dies zu einer Schädigung des Gehirns führen kann.
- Sobald 15-20 Gehirne präpariert wurden, geben Sie 1 ml SSM in eine Vertiefung eines sterilen 12-Well-Kulturtabletts. Übertragen Sie die frisch präparierten Gehirne mit einer Mikropipette und einer sterilen Spitze in das SSM (Abbildung 2A).
- Legen Sie die Gehirne in das SSM-Medium in das 12-Well-Kulturtablett für 24 Stunden bei 25 °C in einen Inkubator (Abbildung 2A).
Tabelle 1: Rezept für die Herstellung von ergänzten Schneider'schen Medien (SSM). In der Tabelle ist das Volumen aller Zutaten aufgeführt, die für die Zubereitung von 5 ml SSM erforderlich sind.
| Zutat (Ausgangskonzentration) | Zur Herstellung von 5 mL | Endkonzentration |
| Schneiders Drosophila media | 3,89 mL | |
| Fötales Rinderserum (100%) | 500 μL< | 10 % |
| Glutamin (200 mM) | 500 μL | ca. 20 mM |
| Penicillin (5000 Einheiten/ml), Streptomycin (50.000 μg/ml) | 100 μL | 1000 U/ml Pen, 1 mg/ml Streptokokken |
| Insulin (10 mg/ml) | 10 μL | 0,02 mg/ml |
| Glutathion (50 mg/ml) | 5 μL | 0,05 mg/ml |
| In einer sterilen Haube mit steriler Technik alle Zutaten zusammen in ein konisches 14-ml-Röhrchen geben. Legen Sie es bis zur Verwendung auf Eis. |
