Isolierung von primären Oligodendrozyten der Maus mit immunmagnetischen Beads

Zusammenfassung

Quelle: Flores-Obando, R. E. et al., Schnelle und spezifische immunomagnetische Isolierung von primären Oligodendrozyten der Maus. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung primärer Oligodendrozytenzellen aus einer neuralen Zellsuspension, die von einem Maus-Welpen durch magnetische Trennung gewonnen wurde. Bei der Technik werden magnetische Beads verwendet, die mit Antikörpern beschichtet sind, die spezifisch für Oligodendrozyten-Antigene sind, und ermöglicht so die selektive Isolierung dieser Zellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Dissoziation der Hirnrinde von Mäusen

1. Opfern Sie postnatale 5-7 Tage alte C57Bl/6N-Mausbabys durch schnelle Enthauptung mit einer Schere, die zuvor mit 70 % Ethanol gereinigt wurde.
   Anmerkung: Für jede Zubereitung wurden Großhirnrinde von 5-6 neugeborenen Mäusewelpen verwendet. Im Durchschnitt liefert ein Mäusegehirn 1-1,5 x 10⁶ primäre Oligodendrozyten (Ols).
2. Schneiden Sie die Kopfhauthaut entlang der Mittellinie mit einer kleinen Präparierschere ein und ziehen Sie sie zurück, um den Schädel freizulegen.
3. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig entlang der Mittellinie ab, beginnend von der Öffnung im hinteren Teil des Schädels in Richtung des vorderen Bereichs, und heben Sie ihn mit der Schere an, um das Gehirn nicht zu beschädigen. Schneide dann mit der Öffnung im hinteren Teil des Schädels in Richtung jeder Augenhöhle entlang der Schädelbasis.
4. Ziehen Sie die Kortexe mit einer feinen Pinzette vorsichtig vom Mittelhirn weg und übertragen Sie sie in eine 60-mm-Gewebekulturschale mit 7 ml B27NBMA. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4 für jedes Gehirn und fassen Sie die präparierten Kortexe zusammen.
5. Übertragen Sie die Kortexe in eine neue 60-mm-Gewebekulturschale mit 5 ml Dissoziationspuffer (B27NBMA, 20-30 U/ml Papain und 2.500 U DNase I).
6. Die Kortikale mit einer #15 Skalpellklinge in kleine Stücke von ca. 1 mm³ schneiden und 20 min in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (_{CO 2}) inkubieren.
7. Fügen Sie 1 ml Rinderwachstumsserum (BGS) hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
8. Übertragen Sie die Kortexe zusammen mit dem Dissoziationsmedium mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
9. Beginnen Sie vorsichtig mit der Dissoziation des Hirngewebes, indem Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette 6-8 Mal langsam auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, Blasen zu minimieren.
10. Lassen Sie die Gewebebrocken 2-3 Minuten ruhen und geben Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen.
11. Geben Sie 3 ml B27NBMA mit 10 % BGS/2500 U DNase I zum Gewebepellet.
12. Verwenden Sie eine serologische 5-ml-Pipette, um das Hirngewebe sanft zu dissoziieren, während Sie 6-8 Mal auf und ab pipettieren. Achten Sie darauf, Blasen zu minimieren.
13. Lassen Sie die Gewebebrocken 2-3 Minuten einwirken.
14. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen. Geben Sie 3 ml B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I zum Gewebepellet
.
15. Dissoziieren Sie das Hirngewebe vorsichtig mit einer P1000-Pipettenspitze, während Sie die Mischung aus Medium und Hirngewebe auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14, bis keine großen Gewebebrocken mehr vorhanden sind oder bis B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I erschöpft ist, je nachdem, was zuerst eintritt. Achten Sie darauf, Blasen zu minimieren.
16. Suspension der Poolzelle mit früheren Überständen.
17. Legen Sie das 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die gepoolte Zellsuspension mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig über das 70-μm-Zellsieb.
18. Waschen Sie das Zellsieb, indem Sie 1 ml B27NBMA mit 10 % BGS/DNase I hinzufügen.
19. Entsorgen Sie das Zellsieb. Bringen Sie das Volumen auf 30 ml mit B27NBMA, die 10 % BGS/DNase I enthalten.
20. Übertragen Sie die Zellsuspension in zwei konische 15-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird 10 min lang bei 200 x g zentrifugiert.
21. Entfernen Sie den Überstand, ohne die Zellen der Luft auszusetzen. Der Überstand wird aufgrund von Zelltrümmern trüb sein. Geben Sie 3 ml B27NBMA mit 10 % BGS zum Pellet
.
22. Dissoziieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit einer P1000-Pipette. Bringen Sie das Volumen auf 15 mL mit B27NBMA mit 10 % BGS.
23. Die Zellsuspension wird über ein frisches 40 μm Zellsieb geleitet.
24. Waschen Sie das Zellsieb, indem Sie 1 ml B27NBMA mit 10 % BGS hinzufügen. Entsorgen Sie das Zellsieb.
25. Bringen Sie das Volumen auf 30 mL mit B27NBMA mit 10 % BGS.
26. Übertragen Sie die Zellsuspension in 2 x 15-ml-konische Röhrchen. Die Zellsuspension wird 10 min lang bei 200 x g zentrifugiert.
27. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands, ohne die Zellen der Luft auszusetzen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 mL eiskaltem MCS-Puffer (Magnetic Cell Sorting).

2. Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit

1. Verdünnen Sie 100 μl der Zellsuspension mit 400 μl Trypanblau-Lösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine 1:5-Verdünnung in 0,4 % (w/v) zu erreichen.
2. Zentrieren Sie ein Deckglas über einer Hämozytometerkammer und füllen Sie die beiden Kammern mit 10 μl der Zellverdünnung mit einer P10-Pipette und vermeiden Sie eine Überfüllung. Die Lösung gelangt durch Kapillarwirkung unter das Deckglas.
3. Stellen Sie das Hämozytometer auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus mit 40-facher Vergrößerung ein.
   HINWEIS: Die Zellzahl wird mit einem Handzähler in jedem der fünf Quadrate (vier Ecken und eine Mitte) aufgezeichnet. Nur nicht lebensfähige Zellen absorbieren den Farbstoff und erscheinen blau, während lebende und gesunde Zellen rund und refraktiv erscheinen und den blau gefärbten Farbstoff nicht absorbieren, was eine Bestimmung der Anzahl lebensfähiger und Gesamtzellen pro Milliliter ermöglicht.

>3. Isolierung von O4⁺ Oligodendrozyten

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 10 min.
2. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig durch Vakuumaspiration, um zu vermeiden, dass die Zellen der Luft ausgesetzt werden.
3. Resuspendieren Sie das Pellet in 90 μl MCS-Puffer pro 1 x 10 7 Gesamtzellen, gefolgt von der Zugabe von 10 μl Anti-O4-Kügelchen pro 1 x 10⁷ Zellen.
4. Mischen Sie die Zellsuspension und die Kügelchen, indem Sie das konische 15-ml-Röhrchen 4-5 Mal vorsichtig mit dem Finger schnippen.
5. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 4 °C und schnippen Sie alle 5 Minuten mit dem Finger auf das konische 15-ml-Röhrchen.
6. Waschen Sie die Mischung, indem Sie vorsichtig 2 ml MCS-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen in das Röhrchen geben. Die Mischung bei 200 x g 10 min zentrifugieren.
7. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig durch Vakuumaspiration, um zu vermeiden, dass die Zellen der Luft ausgesetzt werden. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl MCS-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen.
8. Befestigen Sie einen Magnetabscheider an einem Magnetabscheiderständer. Befestigen Sie eine Auswahlsäule an dem Magnetabscheider und platzieren Sie ein 40 μm Zellsieb auf der Säule. Platzieren Sie zwei konische 15-ml- oder ein konisches 50-ml-Röhrchen unter der Trennsäule, um den Durchfluss aufzufangen.
9. Spülen Sie das 40-μm-Zellsieb und die Trennsäule mit 3 mL MCS-Puffer vor und lassen Sie den Puffer durch die Säule laufen, ohne ihn trocknen zu lassen.
10. Geben Sie die Mischung aus Zellsuspension und Kügelchen in das Zellsieb und in die Auswahlspalte.
11. Waschen Sie das 40 μm Zellsieb mit 1 mL MCS-Puffer.
12. Entsorgen Sie das Zellsieb und lassen Sie die Mischung aus Zellen, Kügelchen und Puffer durch die Säule laufen, ohne sie trocknen zu lassen.
13. Waschen Sie die Trennsäule 3 Mal mit 3 mL MCS-Puffer und 1 Mal mit OL-Proliferationsmedien.
14. Nehmen Sie die Trennsäule aus dem Magnetabscheider, setzen Sie sie schnell in ein konisches 15-ml-Röhrchen ein und fügen Sie sofort 5 ml OL-Proliferationsmedium hinzu.
15. Setzen Sie einen Kolben auf die Säule und drücken Sie ihn fest, um die markierten Zellen in das konische 15-ml-Röhrchen auszuspülen.
16. 100 μl Zellsuspension zur Bestimmung der Zellzahl und -viabilität mit Trypanblau und Hämozytometern wie in Abschnitt 3.
    beschrieben entfernen HINWEIS: Eine Zellviabilität von über 80 % wird als akzeptabel angesehen, um mit der Kultivierung von OLs fortzufahren, aber eine Lebensfähigkeit von mehr als 90 % ist optimal.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 ml serologische Pipetten	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 13-676-10J
10ml Spritze Luer-Loc Spitze	BD, Becton Dickinson	309604
15 ml konische Röhrchen	Falke	352097
24-Well-Gewebekulturplatten	Falke	353935
40μm Zellsieb	Fisher Scientific	22368547
50 ml konische Röhrchen	Falke	352098
5 ml serologische Pipetten	Fisher Scientific	13-676-10H
60 mm Gewebekulturplatten	Falke	353002
70μm Zellsieb	Fisher Scientific	22363548
Anti-O4-Kügelchen - Anti-O4-Mikroperlen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-094-543
Autofil komplette Flaschendeckel-Filterbaugruppe, 0,22 μm Filter, 250 ml	USA Wissenschaftlich	Tel.: 6032-1101
Autofil komplette Flaschendeckel-Filterbaugruppe, 0,22 μm Filter, 250 ml	USA Wissenschaftlich	Tel.: 6032-1102
B27 Beilage	Invitrogen	Artikel-Nr.: 17504-044
Rinderwachstumsserum (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
Bsa	Fisher Scientific	Nr. BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
Desoxyribonuklease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
Edta	Fisher Scientific	Nr. S311
Einweg-Skalpelle aus Federn	Andwin Scientific	EF7281C
Traubenzucker	Fisher Scientific	Nr. D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
Insulin	Invitrogen	Artikel-Nr.: 12585-014
Magnetabscheider-Ständer - MACS multistand	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-303
Magnetischer Abscheider-MiniMACS Abscheider	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-302
Millex PES 0,22 μm Filtereinheit	Millipore	SLG033RS
Neurobasales Medium A	Invitrogen	Tel.: 10888-022
Papain	Worthington	LS003126
PBS ohne Ca2+ und Mg2+	Sigma	Nr. D5652
DNase I Stammlösung			1. Bei 12.500 U Desoxyribonuklease I / ml in HBSS auf Eis gekühlt auflösen. 2. Filter auf Eis sterilisieren 3. Aliquotieren bei 200 μl und über Nacht bei -20 °C einfrieren. 4. Lagern Sie die Aliquote bei -20 bis -30 °C.
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ohne Ca2+ und Mg2+)			Lösen Sie den Beutel in 1 Liter Wasser auf, um 1 Liter Medium mit 9,6 Gramm Pulver pro Liter Medium zu erhalten. Bei 2-8 °C lagern.
Trypanblau-Lösung	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 mL Neurobasales Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1,25 mL Glutamax; Filtrieren, sterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
B27NBMA + 10 % BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Rinderwachstumsserum
CNTF-Lösungsmaterial (10 μg/ml; 1000X)			Bestellen Sie bei Peprotech (450-50). Zu 0,1 bis 1 mg/ml gemäß den Anweisungen des Herstellers (kann von Charge zu Charge variieren) in Puffer (z. B. DPBS + 0,2 % BSA) auffüllen. Bei -80 °C lagern. Arbeitslösung (10 μg/ml, 1000X) 1. Auf 0,2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS-Lösung auftragen und mit dem Filter sterilisieren. 2. Verdünnen Sie das Aliquot der Hauptware auf 10 μg/ml in sterilem, gekühltem 0,2 % BSA/DPBS. 3. Aliquotieren (20 μl/Röhrchen) und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff 4. Aliquote bei -80 °C lagern.
Puffer für magnetische Zellsortierung (MCS)			Bereiten Sie die Lösung vor, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,2 und 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA, 5 μg/ml Insulin und 1 g/l Glukose enthält. Sterilisieren und entgasen Sie den Puffer durch Filtrierung, indem Sie ihn durch einen 0,22 μm Millex-Filter leiten. Lagern Sie den Puffer bis zur Verwendung bei 4 °C
Hanks ausgewogene Salze (HBSS) (Sigma			1. 900 ml Wasser (Temperatur 15-20 °C) in einen Zylinder geben und vorsichtig umrühren. 2. Fügen Sie die Leistung hinzu und rühren Sie, bis sie sich aufgelöst hat. 3. Spülen Sie die Originalverpackung mit etwas Wasser aus, um alle Spuren des Pulvers zu entfernen. 4. Fügen Sie der Lösung in Schritt 2. hinzu 5. Fügen Sie 0,35 g Natriumbicarbonat (7,5 % w/v) für jeden Liter Endvolumen hinzu. 6. Rühren Sie weiter, bis es sich aufgelöst hat. 7. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers unter Rühren auf 0,1-0,3 Einheiten unter pH = 7,4 ein, da er während der Filtration ansteigen kann. Die Verwendung von 1N HCl oder 1N NaOH wird empfohlen, um den pH-Wert einzustellen. 8. Fügen Sie zusätzliches Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 1 l < br / > zu bringen 9. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer Membran mit einer Porosität von 0,22 μm. 10. Bei 2-8 °C lagern.