Vorbereitung eines mikrostrukturierten Substrats zur Untersuchung von Schwann-Zell-Phänotypen

Zusammenfassung

Quelle: Xu, Z., Orkwis, et al. Vorbereitung von einstellbaren extrazellulären Matrix-Mikroumgebungen zur Bewertung der Spezifizierung des Schwann-Zell-Phänotyps. J. Vis. exp. (2020).

Das Video beschreibt die Vorbereitung eines mikrostrukturierten Substrats, um die Spezifikation des Zellphänotyps zu untersuchen. Ein proteinbeschichteter PDMS-Stempel mit Mikrostruktur wird verwendet, um das Mikromuster auf ein PDMS-beschichtetes Deckglas zu übertragen. Das Deckglas wird dann mit einem Tensid behandelt, um die Zelladhäsion an den unerwünschten Oberflächen zu verhindern. Anschließend werden Zellen hinzugefügt, um sich im Muster anzusiedeln, und für die weitere Analyse inkubiert.

Protokoll

>1. Vorbereitung und Charakterisierung von einstellbaren Zellkultursubstraten

1. Vorbereitung des Untergrunds
   1. Mischen Sie das Basiselastomer Polydimethylsiloxan (PDMS) und die Härter mit einer Pipettenspitze kräftig in einem Verhältnis zwischen 10:1 und 60:1, bis die Blasen in der Mischung homogen verteilt sind. Entfernen Sie die Blasen durch Vakuumtrocknung, bis die Blasen abgebaut sind.
      HINWEIS: Während der PDMS-Polymerisation vernetzt sich das Härter mit dem Basiselastomer, um die gewünschten mechanischen Eigenschaften des Endprodukts zu erzielen. Die Vernetzungsverhältnisse können angepasst werden, um die PDMS-Steifigkeit zu ändern.
   2. Geben Sie einen Tropfen (~0,2 ml) der getrockneten PDMS-Mischung auf ein quadratisches oder kreisförmiges Deckglas (z. B. 22 mm x 22 mm) und drehen Sie das Deckglas auf einem Spin-Coater bei 2500 U/min für 30 s.
   3. Inkubieren Sie das Deckglas entweder im Ofen bei 60 °C für 1-2 h oder bei Raumtemperatur über Nacht, damit PDMS fest wird.
   4. Behandeln Sie das Deckglas 7 min lang mit UV-Ozon-Reiniger (UV-Wellenlänge: 185 nm und 254 nm), um die Hydrophilie der Oberfläche zu erhöhen. Legen Sie es in eine sterilisierte 6-Well-Platte.
   5. Bevor Sie es für die Zellkultur verwenden, inkubieren Sie die Substrate mindestens 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol.
      ACHTUNG: UV-Ozonreiniger können Ozon erzeugen, das für den Menschen schädlich ist. Arbeiten Sie in einem chemischen Abzug oder mit einer Form der Belüftung.
2. Vorbereitung des mikrostrukturierten Untergrunds
   1. Zeichnen Sie die gewünschte Geometrie und die Klebeflächen der Zellen (900 μm², 1.600 μm² und 2.500 μm²) mit Hilfe einer CAD-Software (Computer Aided Design). Erstellen Sie eine Chrom-Fotomaske basierend auf diesen Mustern eines kommerziellen Anbieters.
   2. Verwenden Sie in einem Reinraum oder in einer staubfreien Umgebung Standard-Fotolithographietechniken, um Siliziumwafer herzustellen. Kritische Parameter für diese spezielle Anwendung sind wie folgt: Fotolack: SU-8 2010; Spin-Profil zum Dispergieren des Fotolacks: 500 U/min für 10 s bei einer Beschleunigung von 100 U/min/s, dann 3500 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 300 U/min/s; Belichtungsenergie des UV-Lichts: 130 mJ/cm2,
      HINWEIS: Die Höhe der Muster auf den Siliziumwafern beträgt nach diesen Parametern ca. 10 μm. Mögliche Risse an der Kante außerhalb der rechteckigen oder dreieckigen Muster können mit einem Lichtmikroskop nach Schritt 1.2.2 gesehen werden. Das Einbrennen des Siliziumwafers bei 190 °C für 30 min hilft, die Risse zu beseitigen.
   3. Legen Sie den strukturierten Siliziumwafer in eine kreisförmige Petrischale mit einem Durchmesser von 150 mm x 15 mm und gießen Sie das entgaste PDMS (Mischungsverhältnis 10:1), wie in Schritt 1.1.1 hergestellt, auf den Siliziumwafer.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dicke des PDMS mindestens 5 mm beträgt, um die Handhabung bei Mikrokontakt-Druckschritten zu erleichtern.
   4. PDMS über Nacht auf einem Siliziumwafer im Ofen bei 60 °C verfestigen. Lassen Sie PDMS auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie mit einem chirurgischen Skalpell präzise quadratische Stempel im Format 30 mm x 30 mm mit den korrekten Mustern aus dem Siliziumwafer. Beschädigen Sie den Siliziumwafer nicht.
      HINWEIS: Siliziumwafer können zu diesem Zeitpunkt viele Male wiederverwendet werden, um nach der Reinigung mit Isopropanol mehr Stempel herzustellen.
   5. Die PDMS-Stempel und die abstimmbaren Deckgläser (die in den Schritten 1.1.1 bis 1.1.3 vorbereitet wurden) werden sterilisiert, indem sie 30 Minuten lang in 70%iges Ethanol getaucht werden.
   6. Um die Wirksamkeit des Mikromusters durch PDMS-Stempel nach dem Mikrokontaktdruck zu bestätigen, trocknen Sie die Oberfläche der PDMS-Stempel mit einem gefilterten Luftstrom und pipettieren Sie 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA) (Texas Red konjugiert), um die gesamte gemusterte Seite des PDMS-Stempels zu bedecken.
   7. Inkubieren Sie PDMS-Stempel 1 h lang bei Raumtemperatur, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen.
   8. Trocknen Sie die Oberfläche von abstimmbaren Deckgläsern mit einem gefilterten Luftstrom und erhöhen Sie die Hydrophilie der Oberfläche, wie in Schritt 1.1.5 beschrieben.
   9. Trocknen Sie die PDMS-Stempel an der Luft, um die restliche BSA-Lösung zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die BSA-Lösung vollständig vom Stempel entfernt wird, da die verbleibende Lösung dazu führt, dass die Stempel beim Mikrokontaktdruck auf dem Deckglas gleiten.
   10. Bringen Sie die gemusterte Seite des Stempels in konformen Kontakt mit dem abstimmbaren Deckglas für die BSA-Adsorption auf der Deckglasoberfläche. Drücken Sie den Stempel 5 Min. lang vorsichtig gegen das Deckglas< /> HINWEIS: Üben Sie keine übermäßige Kraft auf den Stempel aus, da er sich verbiegt und einen unspezifischen Kontakt zwischen dem Stempel und dem Deckglas verursacht. Die richtige Kraft, die auf den Stempel ausgeübt wird, ist für einen erfolgreichen Mikrokontaktdruck unerlässlich.
   11. Untersuchen Sie das Mikromuster mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter (Fluorescein-Isothiocyanat).
   12. Um Zelladhäsionsflächen anstelle von Fluoreszenzmustern zu drucken, ersetzen Sie das BSA-Protein durch Laminin und wiederholen Sie die Schritte 1.2.5 bis 1.2.10.
   13. Entfernen Sie Stempel von Deckgläsern und übertragen Sie Deckgläser in eine sterilisierte 6-Well-Platte. Geben Sie 2 ml 0,2 % w/v Pluronic F-127 Lösung in jede Vertiefung, um die Oberfläche des Deckglases zu bedecken, und inkubieren Sie 1 h lang bei Raumtemperatur.
       HINWEIS: Pluronisches F-127 kann an die PDMS-Oberfläche adsorbiert werden, wodurch die Hydrophobizität der PDMS-Oberfläche erhöht wird, um die Adhäsion der Zellen zu blockieren.
   14. Aspirieren Sie die Pluronic F-127-Lösung und waschen Sie sie 5x mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) und 1x mit dem Zellkulturmedium, bevor Sie die Zellen aussäen. Eine typische Aussaatdichte für SCs beträgt 1.000 Zellen/cm².
   15. Entfernen Sie 45 Minuten nach der Zellaussaat das Zellkulturmedium und waschen Sie die Deckgläser mit PBS 2x, um zu verhindern, dass mehrere SCs am selben Muster haften. Halten Sie die Zellen vor der Quantifizierung 48 Stunden lang in der gewünschten Zellkulturumgebung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Albumin aus Rinderserum (BSA), Texas Red Konjugat	Thermo Fisher Scientific	Nr. A23017	BSA-Färbung zur Darstellung von Mikromustern
Dulbecco's Modifizierter Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Zellkulturmedium
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Zellkulturmedium ergänzend
Fibronektin	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 33010-018	Protein, das zum Beschichten von Deckgläsern verwendet wird
Fluoreszenz-Mikroskop	Nikon	Finsternis Ti2	Fluoreszenz-Mikroskop
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein, das zum Beschichten von Deckgläsern verwendet wird
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Zellkulturmedium ergänzend
Pluronische F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Blockieren Sie die unspezifische Proteinbindung
SYLGARD 184 PDMS Basis- und Härter	Sigma Aldrich	761036	Abstimmbares Polymer zum Beschichten von Deckgläsern
UV-Ozon Reiniger	Novascan		Erhöhen Sie die Hydrophizilität von PDMS