Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Isolierung und Kultivierung von motorischen und sensorischen Nervenfibroblasten und SC (Schwann-Zellen)
- Verwenden Sie sieben Tage alte Sprague-Dawley (SD) Ratten (n=4) vom Experimental Animal Center der Nantong University of China. Setzen Sie die Ratten für 2-3 Minuten in einen Tank mit 5 % Isofluran, lassen Sie die Tiere langsam atmen und keine eigenständige Aktivität haben, und desinfizieren Sie sie dann vor der Enthauptung mit 75 % Ethanol.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Rückenhaut ca. 3 cm ab und entfernen Sie die Wirbelsäule. Öffnen Sie den Wirbelkanal vorsichtig, um das Rückenmark freizulegen.
- Halten Sie das Rückenmark in einer 60-mm-Petrischale mit 2-3 ml eiskalter D-Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS).
- Basierend auf der anatomischen Struktur wird die ventrale Wurzel (Nervus motoris) und anschließend die dorsale Wurzel (Nervus sensibilisus) unter einem Präpariermikroskop exzidiert. Legen Sie sie anschließend in eine eiskalte D-Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS).
- Nach dem Entfernen des HBSS die Nerven mit einer Schere in 3-5 mm große Stücke schneiden und mit 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin bei 37 °C für 18-20 min verdauen. Als nächstes ergänzen Sie mit 3-4 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), um die Verdauung zu stoppen.
- Pipettieren Sie die Mischung etwa zehnmal vorsichtig auf und ab und zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min. Danach wird der Überstand verworfen und der Niederschlag in 2-3 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, suspendiert.
- Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 400-Mesh-Filter, inokulieren Sie die Zellen dann in einer 60-mm-Petrischale und kultivieren Sie sie bei 37 °C mit 5 % CO2. Nach 4-5 Tagen Kultivierung isolieren Sie die Passage 0 (p0) Fibroblasten und SCs, nachdem Sie eine Konfluenz von 90% erreicht haben.
- Isolierung und Kultur von SCs (Abbildung 1)
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25 % (w/v) Trypsin (37 °C) pro 60 mm Petrischale hinzu, um die Zellen 8-10 s lang bei Raumtemperatur zu verdauen. Danach wurden 3 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, hinzugefügt, um die Verdauung zu stoppen.
- Blasen Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette aus, um die SCs zu lösen. Dann die SCs auffangen und bei 800 x g für 5 min zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie den Rückstand in 3 ml DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 2 μM Forskolin und 10 ng/ml HRG und inokulieren Sie die Zellen dann in einer unbeschichteten 60-mm-Petrischale. Nach der Kultivierung bei 37 °C für 30-45 min heften sich die Fibroblasten (einige Fibroblasten werden mit SCs verdaut) am Boden der Schale.
- Der Überstand (einschließlich der SCs) wird in eine andere mit Poly-L-Lysin (PLL) beschichtete mittlere Schale überführt und 2 Tage lang bei 37 °C kultiviert.
