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1. Vorbereitung der Endothelkultur der Maus in permeablen Stützeinsätzen
HINWEIS: BEND3-Zellen werden gemäß den Anweisungen des Herstellers gewartet.
- Bereiten Sie das BEND3-Zellmedium (BM) vor, indem Sie 50 ml FBS und 5 ml Penicillin-Streptomycin in 500 ml DMEM geben und gut mischen.
- Saugen Sie das Medium aus der Schale ab und waschen Sie die BEND3-Zellkultur einmal mit 1 mL PBS. Geben Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in die Zellen und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang bei 37 °C.
- Geben Sie 1 ml BM in die Zellen, um Trypsin-EDTA zu neutralisieren, und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen vollständig zu dissoziieren. Die Zellsuspension wird in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (RT) für 5 min bei 400 x g pelletiert.
- Aspirieren Sie den Überstand aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen mit 9 ml frischem BM, dann fügen Sie 1 ml Zellsuspension in einen permeablen Stützeinsatz hinzu. Geben Sie weitere 2 mL frisches BM pro Vertiefung in die untere Kammer der Matrix. Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang.
2. Aufbau der neural-endothelialen Co-Kultur und des Ac4ManNAz-Markierungssystems
- Einen Tag nach dem Plattieren der BEND3-Zellen in den Einsätzen wird zuerst das Medium in der unteren Kammer und dann die Einsätze sanft abgesaugt. Waschen Sie die Oberfläche der Einlagen 3 Mal mit vorgewärmtem DMEM (Dulbecco's modifizierter Adler Medium). Waschen Sie die Außenfläche der Einlagen, indem Sie sie mit vorgewärmtem DMEM abspülen.
- Geben Sie 1 ml vorgewärmtes AM (adhärentes Medium) in einen Einsatz und übertragen Sie die Einsätze dann in die Vertiefungen mit den primären kortikalen Zellen. Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 °C und 5 % CO2 für 12 h.
- Ac4ManNAz wird in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst, um eine Stammkonzentration von 200 mM zu erreichen. 12 h nach dem Aufbau der neural-endothelialen Co-Kultur 1 μl Ac4ManNAz-Stamm pro Bodenkammer und 0,5 μl Stamm pro Insert in die Co-Kultur geben. Schütteln Sie die Platten sofort und vorsichtig, um das Medium gut zu vermischen. Fügen Sie für die Kontrollzellen das gleiche Volumen DMSO hinzu.
- Kultivieren Sie die Zellen für weitere 5 Tage bei 37 °C und 5 % CO2. Bereiten Sie das AM mit 10x bFGF als Refeeding-Medium (RM) vor. Während dieser Zeit fügen Sie 100 μl RM pro Einsatz und 200 μl RM pro Bodenkammer hinzu, um die Endothel- und Nervenzellen jeden zweiten Tag neu zu füttern. Geben Sie während der Wiederfütterung weder Ac4ManNAz noch DMSO in die Kultur.