Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Lösungen und Arzneimittel
- Physiologische Salzlösung (PSS)
- Bereiten Sie mindestens 1 l PSS mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und 10 mM Glukose vor.
- Bereiten Sie die notwendigen Lösungen ohne CaCl2 (null Ca2+ PSS) für die Dissektion der Hirnarteriolen und die Isolierung der Endothelröhre vor.
Anmerkung: Bereiten Sie alle Lösungen in hochreinem deionisiertem H2O vor und filtrieren Sie anschließend (0,22 μm). Stellen Sie sicher, dass das Endprodukt einen pH-Wert von 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 290 und 300 mOsm enthält.
- Rinderserumalbumin (BSA, 10%)
- 1 g des lyophilisierten BSA-Pulvers wird in einem Becherglas mit 10 ml Null Ca2+ PSS gelöst. Den Becher abdecken und unter langsamem Rühren mindestens 2 h ziehen lassen, bis sich der Becher aufgelöst hat.
- Filtrieren Sie die Lösung mit einer 10-ml-Spritze plus einem 0,22-μm-Filter und bereiten Sie 1-ml-Aliquots für die Lagerung bei -20 °C vor.
- Lösung zum Sezieren
- Fügen Sie 500 μl BSA (10 %) zu 49,5 mL Null Ca2+ PSS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 mL zu erhalten.
- Übertragen Sie die Lösung in eine Petrischale für arterioläre Dissektionen.
- Dissoziationslösung
- Fügen Sie 5 μl CaCl2-Lösung (1 M) und 500 μl BSA (10 %) zu 49,5 ml NullCa2+ PSS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 ml zu erhalten. Die Lösung mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Enzyme
- Bereiten Sie 1 ml Aufschlusslösung mit 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythrit, 250 μg/ml Kollagenase (Typ-H-Mischung) und 40 μg/ml Elastase vor.
Anmerkung: Die Enzymaktivitäten können variieren, obwohl erfolgreiche Protokolle wahrscheinlich die folgenden enzymatischen Aktivitäten erfordern: ≥ 10 Einheiten/mg für Papain, ≥ 1 Einheit/mg für Kollagenase und ≥ 5 Einheiten/mg für Elastase.
>2. Isolierung von Parenchymalarteriolen
HINWEIS: Für dieses Protokoll werden Arteriolen ausgewählt, die aus den mittleren Hirnarterien (MCAs) entspringen und in das Hirnparenchym eingebettet sind. Die Arteriolen werden wie zuvor beschrieben11 isoliert, mit Modifikation.
- Befestigen Sie das isolierte Gehirn mit Stahlstiften (Durchmesser: 0,2 mm, Länge: 11 bis 12 mm) in einer Petrischale, die eine mit Holzkohle angereicherte Silikonpolymerbeschichtung (Tiefe ≥ 50 cm) enthält.
- Schneiden Sie mit einer scharfen und ausgerichteten Präparierschere ein Rechteck aus Hirngewebe (Länge: 5 mm, Breite: 3 mm) (Abbildung 1B) um die MCA herum und stellen Sie dabei sicher, dass der obere Teil des Gewebesegments hinter dem Verzweigungspunkt vom Willis-Kreis liegt. Schneiden Sie ein weiteres Rechteck aus Hirngewebe aus der anderen Gehirnhälfte ab, um bei Bedarf Zugang zu mehr Arteriolen zu erhalten.
- Befestigen Sie das abgetrennte Hirngewebesegment mit dem MCA nach oben (distal vom Circle of Willis) mit Stahlstiften (Durchmesser: 0,1 mm, Länge: 13 bis 14 mm) in der Schale. Machen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt in der Nähe der Stifte, um die Pia mit einer kleinen Pinzette zu entfernen, und schälen Sie sie vorsichtig von einem Ende zum anderen (Abbildung 1C). Entfernen Sie die Pia aus dem anderen Gewebesegment, um bei Bedarf Zugang zu mehr Arteriolen zu erhalten. Befestigen Sie die isolierte Pia vorsichtig mit parenchymalen Arteriolen, die von MCA abgezweigt sind, in der Schale mit den Stiften und präparieren Sie die parenchymalen Arteriolen (Abbildung 1D), wobei Sie darauf achten, dass die Arteriolen nicht beschädigt werden.
Anmerkung: Wenn die Arteriolen nicht leicht mit der Pia aus dem Parenchym herausgezogen werden können, verwenden Sie eine feine Pinzette und graben Sie sich in das Gehirn ein, beginnend am MCA-Astpunkt vom Willis-Kreis. Lokalisieren Sie die Arteriole, lockern Sie vorsichtig das Gewebe um die Arteriolen (Abbildung 1E) und ziehen Sie die Arteriole vorsichtig aus dem Parenchym heraus, wobei Sie das obere Ende der Arteriole festhalten (Abbildung 1F). Mehrere Arteriolen (Länge: ~1,5-2 mm) können aus einem Rechteck des Hirngewebes isoliert werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Arteriole sauber ist und kein Gewebe daran haftet, und schneiden Sie alle verbleibenden distalen Äste ab (Abbildung 2A). Verwenden Sie diese saubere, intakte Arteriole für die enzymatische Verdauung. Alternativ können Sie jede Arteriole in zwei Stücke (Länge: 0,75-1 mm) für den enzymatischen Aufschluss zur Herstellung von Endothelröhrchen schneiden, falls gewünscht.
>3. Verdauung parenchymaler Arteriolen und Aufbereitung von Endotheltuben
- Anordnung der Geräte und Pipetten
Anmerkung: Die Isolierung von arteriellen Endothelröhren aus dem Gehirn wurde bereits beschrieben13,18. Das derzeitige Protokoll enthält Modifikationen für die Isolierung von Endothel aus parenchymalen (intrazerebralen) Arteriolen. Mehrere Arteriolen und/oder Teile von Arteriolen können zusammen für die enzymatische Verdauung verwendet werden.
- Die Verreibungsvorrichtung13 zum Vorbereiten von Endothelröhren unter Verwendung eines Aluminiumtisches, der eine Kammer und Mikromanipulatoren trägt, zusammenbauen. Bauen Sie ein Mikroskop zusammen, das mit Objektiven (5x-60x) und einer Kamera ausgestattet ist, die an einen Computermonitor angeschlossen ist. Befestigen Sie eine Mikrospritze mit einer Pumpensteuerung neben dem Tisch und der Probe.
- Befestigen Sie eine mit Mineralöl verfüllte Verreibpipette über dem Kolben der Mikrospritze. Verwenden Sie die Mikrospritze mit der Pumpensteuerung, um die Dissoziationslösung in die Verreibpipette (~130 nL) auf dem Mineralöl zu ziehen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen in der Pipette entstehen.
- Partielle Verdauung der arteriolären Segmente
- Legen Sie intakte arterioläre Segmente in 1 ml Dissoziationslösung in ein 10 ml-Glasröhrchen, das 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythrit, 250 μg/ml Kollagenase und 40 μg/ml Elastase enthält. Inkubieren Sie arterioläre Segmente bei 34 °C für 10-12 Minuten.
- Ersetzen Sie nach dem Aufschluss die Enzymlösung durch 3-4 ml frische Dissoziationslösung bei Raumtemperatur.
- Isolierung der arteriolären Endothelröhre
HINWEIS: Nach dem Aufschluss und dem Austausch der Enzymlösung ein oder mehrere teilweise verdaute Segmente in eine Superfusionskammer, die an einer mobilen Plattform befestigt ist, in die Dissoziationslösung überführen. Bei der Betrachtung mit 100- bis 200-facher Vergrößerung wählen Sie ein teilweise verdautes, aber ununterbrochenes Gefäßsegment aus und fokussieren Sie es unter dem Mikroskop.
- Legen Sie die an den Mikrospritzen-Injektor angeschlossene Verreibpipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßsegments. Stellen Sie an der Pumpensteuerung eine Rate im Bereich von 1-3 nL/s für eine sanfte Verreibung ein.
- Unter Beibehaltung einer 100- bis 200-fachen Vergrößerung ziehen Sie das arterioläre Segment in die Pipette zurück und werfen Sie es dann aus, um die Adventitia- und glatten Muskelzellen zu dissoziieren (Abbildung 1B). Trituieren Sie das Gefäßsegment, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und nur noch Endothelzellen als intakte "Röhre" übrig bleiben.
Anmerkung: Falls während der Verreibung erforderlich, verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette mit feiner Spitze, um die dissoziierte Adventitia und die innere elastische Lamina aus dem Endothelrohr zu entfernen. Typischerweise ergeben nur wenige Verreibungszyklen eine intakte Endothelröhre.
- Verwenden Sie Mikromanipulatoren, um jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckglas in der Kammer mit Borosilikatglaspipetten zu befestigen (Abbildung 2C, D).
- Sicherung des arteriolären Endotheltubus
- Ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch eine Superfusionslösung (PSS mit 2 mM CaCl2) und stellen Sie sicher, dass nicht-endotheliales Material aus der Kammer ausgewaschen wird.
- Übertragen Sie das gesicherte Endothelrohr in der mobilen Plattform in das Mikroskopstativ, das für kontinuierliche Superfusion und intrazelluläre oder fluoreszierende Aufzeichnungen/Bildgebung ausgelegt ist.
- Wenden Sie während des Experiments eine kontinuierliche Abgabe von PSS an. Stellen Sie die Durchflussrate (5-7 ml/min) während des gesamten Experiments mit dem Inline-Durchflussregelventil manuell ein, konsistent mit der laminaren Strömung, während die Zuführung des Lösungsstroms an das Ausmaß der Vakuumabsaugung angepasst wird. Lassen Sie ≥5 Minuten PSS-Fluss in die Kammer für die Superfusion des Endothelröhrchens, bevor Sie Hintergrunddaten und/oder Farbstoffbeladung erfassen.
