Generierung eines pro-inflammatorischen Organkulturmodells zur Simulation einer frühen Bandscheibenerkrankung

Zusammenfassung

Quelle: Saravi, B., et al. Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kultivierung von Rinderbandscheiben in Bioreaktoren, um ein dreidimensionales Organkulturmodell zu entwickeln. Spezifische nährstoffarme Medien und degenerative Druckbedingungen werden auf die Bandscheiben angewendet, die die proinflammatorische und degenerative Mikroumgebung nachahmen, die bei Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium beobachtet wird. Die Scheibenhöhen werden nach der Behandlung gemessen, um die Auswirkungen von Nährstoffmangel und degenerativer Belastung zu analysieren.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Dissektion der Rinderscheibe

1. Spülen Sie den gesamten Schwanz gründlich mit Leitungswasser ab, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen.
   Anmerkung: Bei intakten, distalen Enden können je nach gewünschter Größe der IVDs maximal 9 Bandscheiben (IVDs) (Steißbein 1-9) pro Schwanz für die Versuche verwendet werden. Unter Berücksichtigung des gewünschten Durchmessers zwischen 15-20 mm verwendeten wir für die Versuche 12 Rinderschwänze mit 5 IVDs pro Schwanz.
2. Tauchen Sie den ganzen Schwanz für 10 min in eine Schachtel mit 1%iger Betadinlösung. Trocknen Sie den Schwanz kurz mit steriler Gaze ab und legen Sie ihn auf ein steriles Tuch.
   Anmerkung: Befeuchten Sie während der Dissektion der Scheibe die Schwänze mit der benetzten Gaze der Ringer-Lösung, um eine Austrocknung zu verhindern. Lagern Sie die Schwänze (oder übrig gebliebene Segmente) in nasse Gaze eingewickelt, bis der gesamte Präpariervorgang abgeschlossen ist.
3. Verwenden Sie ein Skalpell (Nr. 20), um das Weichgewebe so vollständig wie möglich von der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querfortsätze der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange.
   Anmerkung: Wählen Sie IVDs mit dem gewünschten Durchmesser aus. In der aktuellen Studie wurden IVDs mit einem Durchmesserbereich von 15-20 mm verwendet.
4. Schneiden Sie mit einer Knochenzange quer durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um einzelne Bewegungssegmente zu erhalten. Legen Sie Bewegungssegmente in eine Petrischale mit Gaze, die mit Ringer-Lösung benetzt ist.
5. Lokalisieren Sie das IVD und den Wirbel durch Abtasten und durch leichtes Bewegen der Bewegungssegmente. Machen Sie mit der Bandsäge zwei parallele Schnitte in der Wachstumsfuge der IVDs, einen auf jeder Seite des IVD. Identifizieren Sie die Position der Wachstumsfuge, indem Sie die konvexe Stelle des knöchernen Endplattenteils (hart) neben der Bandscheibe (weich) mit einem Sicherheitsabstand von ca. 0,5 bis 1 mm vom IVD zum Wirbel berühren und finden. Stellen Sie sicher, dass das Sägeblatt der Bandsäge mit Ringer-Lösung gekühlt wird, während Sie die Wirbel schneiden.
6. Übertragen Sie IVDs in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze, die mit Ringer-Lösung benetzt ist.
   Anmerkung: Die Gaze sollte angefeuchtet und nicht zu nass sein, um ein Aufquellen der IVDs zu verhindern.
Mit
7. der Skalpellklinge den Wirbelkörper (roter/rosa Knochen), die Wachstumsfuge (weißer Knorpel) abkratzen, die Endplatte intakt lassen (gelb-rosa). Machen Sie die beiden Flächen für den Ladevorgang flach und parallel. Übertragen Sie die abgeschabten IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit der Ringer-Lösung benetzt wurde.
   Anmerkung: Tragen Sie einen Kettenhandschuh, um die Hand zu schützen, während Sie das IVD halten und kratzen.
8. Messen Sie die Höhe und den Durchmesser der Scheibe mit einem Messschieber. Reinigen Sie die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit der Ringer-Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.
9. Übertragen Sie die IVDs auf 50 mL Kunststoffröhrchen, ein IVD pro Röhrchen. Fügen Sie 25 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 10 % Penicillin/Streptomycin (P/S) pro IVD hinzu und lassen Sie es 15 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur schütteln.
10. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 Minuten lang 10 ml PBS + 1 % P/S pro IVD hinzu, um die IVDs zu spülen.

>2. IVD-Kultur und -Belastung

1. Übertragen Sie die Discs in IVD-Kammern und fügen Sie IVD-Kulturmedium hinzu (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM mit hohem Glukosegehalt für die physiologische Gruppe und 2 g/L DMEM mit niedrigem Glukosegehalt für die pathologische Gruppe) + 1 % P/S + 2 % fötales Kälberserum + 1 % ITS (enthält 5 μg/ml Insulin, 6 μg/ml Transferrin, und 5 ng/ml Selensäure) + 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat + 1 % nicht-essentielle Aminosäure + 50 μg/ml antimikrobieller Wirkstoff für Primärzellen) und in einen Inkubator bei 37 °C, 85 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ stellen.
2. Kultivieren Sie die Scheiben 4 Tage lang in einem Bioreaktorsystem gemäß Versuchsgruppen. In der pathologischen Gruppe sind degenerative Belastungsbedingungen bei 0,32-0,5 MPa, 5 Hz für 2 h/Tag zu halten. In der physiologischen Kontrollgruppe ist ein Belastungsprotokoll von 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz für 2 h/Tag zu verwenden
   Anmerkung: Positionieren Sie die IVDs während des Ladevorgangs in Kammern mit 5 ml IVD-Medium. Das Volumen hängt von der Größe der Beladekammern des Bioreaktors ab. Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit 7 ml IVD-Kulturmedium, um die freie Quellung wiederherzustellen.
3. Um die Veränderungen der Bandscheibenhöhe während des Versuchszeitraums zu analysieren, messen Sie die Bandscheibenhöhe mit einem Messschieber nach der IVD-Dissektion (Baseline) und dann täglich nach der freien Quellphase und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ascorbat-2-phosphat	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	Nr. A8960
Bandsäge	Exakt Apparatebau, Norderstedt, Deutschland	Modell 30/833
Betadin	Munndipharma, Frankfurt, Deutschland
Corning ITS Vormischung	Corning Inc., New York, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 354350
DMEM mit hohem Glukosegehalt	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM niedriger Glukosespiegel	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
Ethanol für die Molekularbiologie	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	Tel.: 09-0851
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
Nicht-essentielle Aminosäurelösung	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11140050
Penicillin/Streptomycin(P/S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
Phosphatpufferlösung, Tablette	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	Nr. P4417
Primocin	InvivoGen, Sandiego, Vereinigte Staaten von Amerika	Ant-PM-05
Pulsavac Jet Lavage-System	Zimmer, IN,USA