Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Neuronen mit gentechnisch veränderten Lentiviren

Abstract

Quelle: Assetta, B., et al., Generation von menschlichen Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen. J. Vis. (2020).

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung in Neuronen durch Transfektion mit gentechnisch veränderten Lentiviren, die ein neurogenes Transkriptionsfaktor-Gen tragen, unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements, gefolgt von einer Behandlung mit einem Tetracyclin-Derivat und einem Reifungsmedium.

Protocol

>1. Induktion menschlicher Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

1. Lentivirus-Vorbereitung (~5 Tage, detailliertes Protokoll wie zuvor beschrieben)
   1. Platte ~1 Million HEK293T Zellen in jedem T75-Kolben, um sie bei der Transfektion zu ~40 % konfluent zu haben. Transfizieren Sie sie mit Plasmiden, die das Tetracyclin-induzierbare Ngn2 und das Puromycin-resistente Gen (PuroR; unter derselben TetO-Promotorkontrolle), rtTA exprimieren, und den drei Helferplasmiden pRSV-REV, pMDLg/pRRE und VSV-G (12 μg lentivirale Vektor-DNA und je 6 μg der Helferplasmid-DNA). Bereiten Sie mindestens drei Flaschen pro Lentiviruspräparation vor. Verwenden Sie PEI für die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wechseln Sie das Medium nach 16 h und entsorgen Sie es.
   2. Ernten Sie freigesetzte Viruspartikel, indem Sie jeden Tag Nährmedien sammeln und 3 Tage lang durch frische Medien ersetzen. Bündeln Sie die gesammelten Medien, die Viruspartikel enthalten, zur Reinigung. Das Virus durch einen 0,22 μm Filter filtrieren und 90 min bei 49.000 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in der entsprechenden Menge PBS-Glukose (~150 μL).
2. Neuronen-Induktion (~5 Tage)
   Anmerkung: Dieses Induktionsprotokoll (Abbildung 1A; Flussdiagramm) ist sowohl für iPS- als auch für ES-Zellen mit validierter Pluripotenz hochwirksam (die durch immunhistochemische Färbung von gut charakterisierten Pluripotenzmarkern getestet werden können; Abbildung 1B).
   1. Verwenden Sie kommerziell erhältliche humane H1-ES-Zellen bei der Passage von 52 (siehe Materialtabelle). Kultivieren Sie die Zellen auf mit extrazellulärer Matrixlösung beschichteten 6-Well-Platten (~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte; siehe Materialtabelle) mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   2. An Tag -2 werden ES-Zellen (80 % konfluent) mit 1 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) abgetrennt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden in ein Röhrchen überführt, die Vertiefung mit 2 ml Medium gewaschen und im selben Röhrchen vermischt. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g, resuspendieren Sie das Pellet in Medien und plattieren Sie die Zellen auf matrixbeschichtete 6-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 1 x 10₅ Zellen pro Well.
   3. An Tag -1 werden den ES-Zellen in frischem ES-Zellerhaltungsmedium Lentiviren, die Ngn2 plus PuroR und rtTA exprimieren, zusammen mit Polybren (8 μg/ml) zugesetzt (siehe Materialtabelle). Die genaue Menge an Viren sollte durch tatsächliche Titer bzw. die Titration bestimmt werden. In der Regel fügen wir 5 μl pro Virus pro Well in einer 6-Well-Platte hinzu.
   4. An Tag 0 Doxycyclin (2 μg/ml zur Aktivierung der Ngn2-Expression) in DMEM-F12-Medium mit N2-Supplement ohne Morphogene hinzufügen.
   5. An Tag 1 geben Sie Puromycin in frischem Medium aus DMEM-F12 plus N2 und Doxycyclin bis zur Endkonzentration von 1 μg/ml Medium hinzu. Selektieren Sie die transduzierten Zellen in Puromycin für mindestens 24 Stunden. Eine höhere Puromycin-Konzentration (bis zu 5 μg/ml) und ein längerer Selektionszeitraum (bis zu 48 h) können erforderlich sein, um die untertransduzierten Zellen angemessen zu entfernen, wenn der Virustiter niedrig ist.
   6. An Tag 2 lösen Sie differenzierende Neuronen mit Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle), plattieren Sie sie erneut auf 24-Well-Platten (zwischen 80.000 und 200.000 Zellen/Well), die mit Matrixlösung beschichtet sind (siehe Materialtabelle), und halten Sie sie in NBA/B27-Medium ohne Doxycyclin. Die Aussaatdichte ist entscheidend.
   7. In diesem Stadium können abgelöste Neuronen in einem speziellen kommerziellen Gefriermedium eingefroren werden (siehe Materialtabelle) und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Reine Neuronen können plattiert werden, wobei der typische Zelltod von ~15 % bis 20 % nach dem Auftauen berücksichtigt wird, allein kultiviert oder mit anderen Gehirnzelltypen co-kultiviert werden.
   8. Kulturieren Sie reine iNs auf den Platten, die mit Lösungen auf Basis extrazellulärer Matrix beschichtet sind, wie vom Hersteller angegeben (siehe Materialtabelle). Die charakteristische pyramidale Morphologie sollte an Tag 4 (und Tag 6; Abbildung 1C). Die Synapsenbildung kann bereits an Tag 14 bis 16 nachgewiesen werden und ist an Tag 24 durch immunhistochemische Färbung mit prä- und postsynaptischen Standardmarkern ausgeprägt. (Abbildung 1D; beschriftet mit dem präsynaptischen Marker Synapsin 1 und dem dendritischen Marker Map2).

Results

Abbildung 1: Direkte Generierung von human-induzierten Neuronen (iNs) aus hPSCs. (A) Flussdiagramm der iN-Erzeugung. (B) Repräsentative Hellfeld- und Immunfluoreszenzbilder der Ausgangskultur von humanen pluripotenten Stammzellen (H1) zur Bestätigung der Pluripotenz. Oct4 wird in Rot und Sox2 in Grün dargestellt. (C) Repräsentative Hellfeldbild...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	STEMCELL-Technologien	7920
B27 Beilage	ThermoFisher	17504044
DMEM/F12 mittel	STEMCELL-Technologien	Artikel-Nr.: 36254
Dmso	ThermoFisher	Nr. D12345
doxycyclin	MilliporeSigma	Nr. D3072
H1 humane ES-Zellen	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	STEMCELL-Technologien	Artikel-Nr.: 5825
N2-Ergänzung	ThermoFisher	17502001
Neurobasal Ein Medium	ThermoFisher	Tel.: 10888-022
Nicht essentielle Aminosäuren	ThermoFisher	Tel.: 11140-050
Pei	VWR	Tel.: 71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	Artikel-Nr.: 12251
Polybrene	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	Artikel-Nr.: 12253
Puromycin	ThermoFisher	A1113803
STEMdiff Einfriermedien für neuronale Vorläufer	STEMCELL-Technologien	5838
STEMdiff SMADi Neuronales Induktionskit	STEMCELL-Technologien	Nr. 8581
Tempo-iOlogo: Humane iPSC-abgeleitete OPCs	Tempo BioScience	Artikelnummer102
TetO-NG2-Puro	Addgene	Artikel-Nr.: 52047
VSV-G	Addgene	Artikel-Nr.: 12259